膿毒癥患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群PD-1表達(dá)率的臨床研究

李少洪,鐘 堅(jiān)，陳 丹，張 偉，張磊云，余 濤，黃子通

1.東莞東華醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，廣東 東莞 523110; 2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，廣州 510120

膿毒癥的高發(fā)病率和高病死率是急危重癥領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者的非特異性全身炎癥反應(yīng)和特異性免疫功能均下降，免疫抑制及其共抑制分子成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。有研究表明，共抑制分子尤其是負(fù)性共抑制分子的過(guò)度表達(dá)與患者的病死率及預(yù)后顯著相關(guān)[2]。程序性死亡因子-1(programmed cell death-1,PD-1)是目前廣泛關(guān)注的一種共抑制分子，PD-1及其配體通過(guò)調(diào)控多種免疫細(xì)胞的功能，參與固有免疫和獲得性免疫，對(duì)膿毒癥患者的嚴(yán)重程度和預(yù)后有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值[3]。本研究回顧性分析2019年1月—2020年1月東莞東華醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)或ICU收治的60例膿毒癥患者的臨床資料，旨在探討膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群PD-1的表達(dá)能否預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展。

資料與方法

1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲； (2)符合2016年《SSC(拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng))指南》中膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腫瘤、自身免疫性疾病及原發(fā)器官功能障礙； (2)入院前2周使用糖皮質(zhì)激素或其他影響免疫功能藥物； (3)妊娠、哺乳及月經(jīng)期女性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017DHLLO13)，獲得患者或家屬的知情同意。

共納入膿毒癥患者60例，其中男性32例，女性28例；平均年齡(59.7±17.7)歲；致傷原因：道路交通傷24例，意外跌傷12例，高處墜落傷7例，擠壓傷3例，燒燙傷2例，其他傷12例；感染灶分布：肺部感染14例，泌尿系感染6例，腸道感染2例，肝膿腫5例，膽道感染3例，外科相關(guān)腹腔感染21例，創(chuàng)傷后皮膚軟組織感染7例，術(shù)后腸瘺2例。非膿毒癥患者43例，其中男性23例，女性20例；平均年齡(51.7±22.0)歲；致傷原因：道路交通傷18例，意外跌傷9例，高處墜落傷3例，銳器傷5例，燒燙傷1例，其他傷7例；感染灶分布：肺部感染13例，泌尿系感染5例，肝膿腫4例，腸道感染3例，膽道感染5例，外科相關(guān)腹腔感染13例。兩組患者一般資料比較，包括年齡、性別、住院天數(shù)、基礎(chǔ)疾病(高血壓病、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2 觀察指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：血液常規(guī)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、生化、凝血功能、炎癥指標(biāo)、降鈣素原(PCT)等，由東莞東華醫(yī)院驗(yàn)科統(tǒng)一檢測(cè)。以入院24h內(nèi)的最差指標(biāo)值評(píng)估并記錄患者的急性生理和慢性健康評(píng)分(APACHEⅡ)和序貫性器官衰竭評(píng)分(SOFA)。

3 外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)及T淋巴細(xì)胞功能相關(guān)參數(shù)的檢測(cè)

外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)率的檢測(cè)：(1)分別加入不同的抗體(CD3、CD4、CD8、PD-1)，加入適量(50～100μL)的抗凝全血，充分混勻后室溫避光孵育15min； (2)在每一管中加入熒光激活細(xì)胞分選器溶血素工作液2mL，低速漩渦混勻，室溫避光靜置10min； 溶血后以300離心力(單位：×g)離心5min； (3)棄去上清液，加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，以300×g離心洗滌5min； (4)棄去步驟(3)上清液，加入200～500μL PBS(依細(xì)胞濃度而定)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)BD FACS Canto Ⅱ)，并用FACS DIVA軟件(BD公司流式分析軟件)，建立相應(yīng)的獲取模板，調(diào)好上機(jī)條件，將樣本上機(jī)獲取數(shù)據(jù)，后進(jìn)入分析模板，制備相應(yīng)參數(shù)的分析圖形，經(jīng)過(guò)合適的圈門技術(shù)分析目標(biāo)細(xì)胞的相應(yīng)參數(shù)，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果與分析報(bào)告。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

膿毒癥組APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、PCT、CRP、白介素-6(IL-6)均較高，血紅蛋白、血小板、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、肌酐、尿素氮、前白蛋白、白蛋白、凝血酶原活性度均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組CD3+T細(xì)胞(%)、CD4+T細(xì)胞(%)、CD8+T細(xì)胞(%)、CD4+/CD8+比值、PD-1+總表達(dá)率、CD4+T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示外周血PCT、CD4+T細(xì)胞中PD-1、CD8+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.581、0.510；0.522、0.490；0.435、0.422，均P<0.05，表3)。通過(guò)多因素Logistic回歸分析篩選出影響膿毒癥發(fā)生的3個(gè)獨(dú)立因素：SOFA評(píng)分(OR=2.150)、PCT(OR=2.721)、CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率(OR=1.257)，均P<0.05(表4)。ROC曲線中曲線下面積(AUC)為[0.770，95%CI(0.680～0.850)，P<0.05]。Youden指數(shù)為0.43，最佳截?cái)嘀禐?.77，靈敏度78.33%，特異度65.12%(P<0.05，圖1)。

圖1 CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率的ROC曲線

表2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果及病情嚴(yán)重程度指標(biāo)比較

表3 PCT、T細(xì)胞亞群PD-1表達(dá)與APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分相關(guān)性

表4 影響膿毒癥發(fā)生危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

討 論

膿毒癥是急診科、重癥醫(yī)學(xué)科的常見(jiàn)危重癥，病死率高，治療難度大，其主要機(jī)制與免疫失調(diào)、失控有關(guān)。在膿毒癥的病情進(jìn)展過(guò)程中，機(jī)體可出現(xiàn)代償性抗炎反應(yīng)，繼而進(jìn)入免疫麻痹狀態(tài)，包括人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)降低、淋巴細(xì)胞表型改變、程序性細(xì)胞死亡、抑炎因子表達(dá)增加和共抑制分子表達(dá)增加等。PD-1是其中一種共抑制分子，PD-1主要包括2個(gè)配體：PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，PD-L2主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上，相關(guān)研究較少，而PD-L1廣泛表達(dá)于造血和非造血細(xì)胞中，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞[4]。PD-1主要在活化的T淋巴細(xì)胞表達(dá)，靜止期的T淋巴細(xì)胞很少表達(dá)[5]，當(dāng)被病原菌等抗原持續(xù)刺激時(shí)，PD-1表達(dá)上調(diào)以對(duì)抗T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化[6]。同時(shí)，PD-1表達(dá)上調(diào)可引起淋巴細(xì)胞的凋亡，最終出現(xiàn)免疫抑制，從而加重膿毒癥患者的病情，加速膿毒癥的進(jìn)展，形成惡性循環(huán)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組患者外周血PD-1+總表達(dá)率(%)10.36(7.89～14.57)明顯高于非膿毒癥組8.26(5.68～11.70，P<0.05)，其中CD4+T淋巴細(xì)胞中PD-1在兩組中的表達(dá)率分別為(17.00±22.17)%和(14.60±4.58)%，P<0.05。

本研究顯示，與非膿毒癥組相比較，膿毒癥組APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分均較高，血紅蛋白、血小板、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿素氮、白蛋白均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，膿毒癥組肌酐、PCT、CRP、IL-6較非膿毒癥組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與非膿毒癥組相比，膿毒癥組淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，CD4+T淋巴細(xì)胞比例上升，CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降，CD4+/CD8+比值升高，這與康秀文等[8]在腹腔感染致膿毒癥患者研究的結(jié)果一致。另外Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)顯著上調(diào)可引起T細(xì)胞耗竭，表現(xiàn)為T細(xì)胞周期阻滯、無(wú)法繁殖，合成細(xì)胞因子減少，以及誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞死亡，導(dǎo)致其下降。

為了進(jìn)一步闡明PD-1在膿毒癥中的作用，Gao等[10]在一項(xiàng)前瞻、隨機(jī)、對(duì)照臨床研究中觀察182例膿毒癥患者，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD8+CTLA-4+表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步Logistic回歸分析顯示CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率可能是膿毒癥的危險(xiǎn)因素，CD4+T細(xì)胞百分比可能是膿毒癥的保護(hù)因素。在本研究中，與非膿毒癥患者相比，膿毒癥患者PD-1+總表達(dá)率、CD4+T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)率較高，且多因素Logistic回歸分析顯示SOFA評(píng)分、CD4+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PCT是影響膿毒癥發(fā)生的獨(dú)立因素，并未發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞百分比的意義，考慮與人群選擇、疾病嚴(yán)重程度等不同有關(guān)。本研究與Gao等[10]研究均證實(shí)了CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率在膿毒癥中的價(jià)值。此外，筆者對(duì)CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率在膿毒癥中的診斷價(jià)值進(jìn)行分析，ROC曲線下面積為0.770(95%CI：0.680～0.850)，靈敏度和特異度均較高(靈敏度78.33%，特異度65.12%)，P<0.05，CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率升高可作為膿毒癥診斷的重要指標(biāo)之一。

本文的局限性在于：(1)研究樣本量較小，需納入更多樣本量去動(dòng)態(tài)分析指標(biāo)及觀察臨床預(yù)后結(jié)局；(2)膿毒癥患者在不同的病程階段，感染病原體、感染病灶、疾病嚴(yán)重程度不同可能會(huì)導(dǎo)致不同的免疫抑制狀態(tài)，后續(xù)研究可在擴(kuò)大樣本量基礎(chǔ)上進(jìn)一步分層分析。

綜上所述，CD4+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率升高是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立因素之一，具有較高的特異度和靈敏度，可作為膿毒癥患者的重要免疫功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。