動(dòng)脈套管聯(lián)合聚乙二醇在大鼠周圍神經(jīng)損傷中的應(yīng)用

聶廣辰，薛 巖,郝旭光，劉 麗，石 健，房玉利，劉 勇

哈爾濱市五院骨外科，哈爾濱 150088

周圍神經(jīng)損傷臨床發(fā)病率極高，中國(guó)每年新增周圍神經(jīng)損傷患者60萬(wàn)～90萬(wàn)例，且大部分患者需要神經(jīng)移植進(jìn)行修復(fù)[1-2]。在周圍神經(jīng)損傷的患者中只有不到一半恢復(fù)良好的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能[3]。周圍神經(jīng)損傷現(xiàn)階段恢復(fù)連續(xù)性的方法為外膜縫合、束膜縫合、外膜聯(lián)合束膜縫合，這些方法在不能明確鑒別神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)束的情況下，均難以避免神經(jīng)功能束的錯(cuò)誤匹對(duì)，且斷端神經(jīng)因?yàn)檠舆t修復(fù)導(dǎo)致連續(xù)性恢復(fù)的過(guò)程受阻，錯(cuò)過(guò)了修復(fù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤的形成[4]。近年來(lái)對(duì)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的研究中，動(dòng)脈套管及聚乙二醇(PEG)表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)，其中動(dòng)脈套管的作用機(jī)制在于周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)近端的再生過(guò)程表現(xiàn)出趨化性，如果有一定空間的間隙，新生的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)神經(jīng)纖維可以經(jīng)它自動(dòng)長(zhǎng)入遠(yuǎn)端相應(yīng)的功能束中，最后到達(dá)靶器官[5-7]。PEG作為一種非離子化親水性聚合物，在生物化學(xué)和藥物學(xué)上應(yīng)用廣泛，常用作細(xì)胞融合相關(guān)領(lǐng)域所需的乳化劑以及均質(zhì)物質(zhì)[8]。PEG 能夠在生物體內(nèi)環(huán)境形成對(duì)周圍水分結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)化作用[9]，形成相對(duì)的疏水結(jié)構(gòu)域，這種特殊的結(jié)構(gòu)域能減少細(xì)胞膜產(chǎn)生的線性彈性，促使破裂細(xì)胞膜發(fā)生融合，同時(shí)促進(jìn)鄰近磷脂層的再塑，為細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的再塑提供良好條件。在哺乳動(dòng)物中軸突的離斷常導(dǎo)致不可逆性的遠(yuǎn)端軸突的華勒變性，但近端節(jié)段功能尚保存，PEG可通過(guò)軸突融合在細(xì)胞水平連接損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)端和近端，避免損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)的華勒變性，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生[10]。動(dòng)脈套管及PEG在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)中，單獨(dú)的報(bào)道很多，但兩者聯(lián)合應(yīng)用的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，聯(lián)合兩種方法進(jìn)行修復(fù)，旨在為臨床上周圍神經(jīng)損傷患者提供一種新的治療思路。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備

本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重(200～250g)。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制訂的《哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范》執(zhí)行。

實(shí)驗(yàn)分組，共144只大鼠，平均分為4組，每組36只。A組：小間隙縫合生理鹽水沖洗；B組：小間隙縫合PEG沖洗；C組：動(dòng)脈套管(同種異體血管)聯(lián)合小間隙縫合生理鹽水沖洗；D組：動(dòng)脈套管聯(lián)合小間隙縫合PEG沖洗。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉藥戊巴比妥鈉(60mg/kg)，備皮后對(duì)右后肢進(jìn)行手術(shù)。將大鼠翻至俯臥位并固定四肢，找到大鼠右側(cè)大腿股骨位置，以此為骨性標(biāo)志在股骨下 0.5cm 處淺層剪開皮膚，作一1～2cm切口，切口位置為股骨在體表的投影位置。打開皮膚后可見一條明顯的白線，為肌肉間的筋膜，在顯微鏡下，沿此白線將其剪開一個(gè)小口，深入血管鉗沿白線方向鈍性分離，用顯微剪刀銳性分離坐骨神經(jīng)周圍的結(jié)締組織，暴露坐骨神經(jīng)干。將A組和B組大鼠坐骨神經(jīng)游離暴露1cm左右，并在手術(shù)顯微鏡下于中間切斷并立即小間隙縫合(1mm)，將生理鹽水(0.5mL，A組)或 PEG-600(西安晉湘藥用輔料有限公司，0.5mL，B組)注入縫合界面。將C組和D組大鼠暴露1cm的坐骨神經(jīng)然后于中間切斷。將近端和遠(yuǎn)端殘端插入主動(dòng)脈套管的兩端，然后將套管的兩個(gè)末端固定到神經(jīng)外膜上，最后將鹽水(0.5mL，C組)或PEG-600(0.5mL，D組)注入動(dòng)脈導(dǎo)管(圖1)。所有組進(jìn)行止血并以標(biāo)準(zhǔn)方式閉合傷口。

圖1 小間隙縫合及動(dòng)脈套管使用示意圖

將所有大鼠放置在舒適的環(huán)境中，12h/12h交替光暗循環(huán)并自由喂食。

本研究設(shè)計(jì)涉及4組SD大鼠(n=144)，每組在1、4周和8周各評(píng)估12只大鼠(n=36)。1周，每組9只大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估及電生理檢測(cè)，3只取材坐骨神經(jīng)組織，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估以及電鏡觀察。

2 行為學(xué)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測(cè)

該項(xiàng)評(píng)估在自制坐骨神經(jīng)指數(shù)盒內(nèi)進(jìn)行，制作一高10cm、長(zhǎng)60cm、寬10cm、兩端開口的木質(zhì)通道，將白紙裁成與木質(zhì)通道等長(zhǎng)等寬鋪至木板表面。訓(xùn)練大鼠自行通過(guò)木板行走。用染料使大鼠雙下肢染色，大鼠置于通道的一開口端，任其行走至另一開口端，雙下肢在白紙上可留下5～6個(gè)腳印。評(píng)估利用了包括感覺(jué)反饋和運(yùn)動(dòng)控制在內(nèi)的SFI。選擇印跡清晰的足印分別測(cè)量正常足(N)和傷側(cè)足(E)的3個(gè)指標(biāo)：PL(腳印長(zhǎng)度)、TS(趾寬度)、IT(中間趾寬度)。把獲得的指標(biāo)代入Bain[9-10]公式，最后獲得SFI。從第3周開始，SFI值有較強(qiáng)指導(dǎo)意義[11]。SFI的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：SFI=0為運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能正常，SFI=100為神經(jīng)完全損傷。

3 電生理學(xué)檢測(cè)

復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)是指電刺激坐骨神經(jīng)，記錄遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)所支配的腓腸肌同步放電的電生理信號(hào)，評(píng)估受損的坐骨神經(jīng)恢復(fù)情況。受檢大鼠腹腔注射麻醉后，暴露并游離包括動(dòng)脈套管在內(nèi)的約2cm坐骨神經(jīng)，將鉤形刺激電極放置在離近端神經(jīng)約1cm處。將針記錄電極放置在相應(yīng)的目標(biāo)腓腸肌上測(cè)量CAMP并觀察記錄其振幅。

4 組織病理學(xué)檢測(cè)

取縫合部位的神經(jīng)節(jié)段和目標(biāo)腓腸肌，并對(duì)其進(jìn)行處理，以對(duì)治療后的神經(jīng)進(jìn)行組織學(xué)分析。HE染色觀察各組腓腸肌萎縮情況及神經(jīng)再生排序情況。透射電子顯微鏡觀察再生神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突及髓鞘外觀。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況

在本實(shí)驗(yàn)中A組及C組大鼠各有1只因麻醉意外死亡，其余大鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中無(wú)意外死亡發(fā)生。

2 行為學(xué)結(jié)果

結(jié)果顯示D組在任何時(shí)間節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)明顯優(yōu)與其他三組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 坐骨神經(jīng)指數(shù)計(jì)算數(shù)值分)

3 電生理學(xué)結(jié)果

術(shù)后1、4、8周行混合肌肉運(yùn)動(dòng)電位CMAP檢查。術(shù)后第1周D組動(dòng)作電位峰值顯著高于其余三組，術(shù)后4周及8周，B組動(dòng)作電位峰值有所提高，但顯著低于D組，A組及C組動(dòng)作電位恢復(fù)不良。結(jié)果提示接受PEG的沖洗對(duì)周圍神經(jīng)正常的生物電傳導(dǎo)功能恢復(fù)有幫助。見圖2。

圖2 各組腓腸肌的體內(nèi)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)

4 HE染色

通過(guò)GraphPad Prism 6 圖像軟件分析，觀察肌肉纖維化程度、肌肉纖維排列的順序和形態(tài)。術(shù)后1周各組可觀察到肌肉萎縮，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組和C組在4周時(shí)萎縮顯著，而B組及D組則萎縮較少。在8周時(shí)，A組和C組的肌肉萎縮情況進(jìn)一步加重，而B組及D組無(wú)論是在肌肉纖維化程度、排列的順序及形態(tài)上較4周時(shí)無(wú)明顯變化。在4周和8周對(duì)坐骨神經(jīng)斷端進(jìn)行HE染色時(shí)，目視檢查 B組及D組中再生纖維有序排列，具有正常直徑和施萬(wàn)細(xì)胞數(shù)；成纖維細(xì)胞增生很少。A組呈現(xiàn)無(wú)序排列，少量再生纖維和稀疏的施萬(wàn)細(xì)胞，C組情況略好于A組。見圖3。

圖3 HE 肌肉(左)和神經(jīng)(右)染色

5 透射電子顯微鏡

術(shù)后4周，尤其是術(shù)后8周，D組再生神經(jīng)纖維數(shù)最多，軸突最厚，髓鞘外觀正常。在B組中，軸突是圓形的，偶有扭曲。再生神經(jīng)纖維的數(shù)量不高，但軸突顯示有序排列，有較規(guī)則的髓鞘層狀分層。而A組及C組中，再生軸突呈不規(guī)則樣，纖維數(shù)較少，髓鞘變形且薄、不規(guī)則。 見圖4。

圖4 透射電子顯微鏡顯示術(shù)后4周和8周軸突形態(tài)的變化

討 論

周圍神經(jīng)重建的效果一直不理想，高質(zhì)量顯微設(shè)備和顯微器械的出現(xiàn)，伴隨的顯微鏡下操作能力的提升使得顯微修復(fù)技術(shù)和顯微外科得到了迅速的發(fā)展[12-14]。近年來(lái)，PEG及動(dòng)脈套管在治療周圍神經(jīng)損傷上取得了較大的進(jìn)展，但將兩者聯(lián)合應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷報(bào)道較少。

PEG治療周圍神經(jīng)損傷的主要機(jī)制是PEG作為一種膜融合劑，能夠在周圍神經(jīng)損傷早期促進(jìn)軸索細(xì)胞膜融合、線粒體膜通透性降低、細(xì)胞色素C釋放、Ca2+濃度調(diào)控，進(jìn)而延緩華勒變性[15]。然而，僅用PEG進(jìn)行軸突融合并不能完全避免華勒變性，因?yàn)榧?xì)胞骨架并未完全修復(fù)，細(xì)胞骨架的迅速重建對(duì)于恢復(fù)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要，重建神經(jīng)連續(xù)性和良好的生物力學(xué)環(huán)境也不可或缺。

動(dòng)脈套管聯(lián)合小間隙縫合很好解決了神經(jīng)連續(xù)性恢復(fù)的問(wèn)題，動(dòng)脈套管聯(lián)合小間隙縫合的應(yīng)用已有近20年歷史，近似封閉的動(dòng)脈套管環(huán)境為近端與遠(yuǎn)端神經(jīng)提供了營(yíng)養(yǎng)支持，形成了一個(gè)有利于神經(jīng)修復(fù)的微環(huán)境[16]。將離斷神經(jīng)近端和遠(yuǎn)端分別插入套管內(nèi)中間保留間隙，近端神經(jīng)高度選擇性地長(zhǎng)入到遠(yuǎn)端相應(yīng)位置，避免了標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)修復(fù)模式下近遠(yuǎn)端匹配錯(cuò)位的問(wèn)題。本研究應(yīng)用大鼠自體動(dòng)脈作為套管橋接神經(jīng)斷端，但在臨床工作中選用自體血管作為動(dòng)脈套管增加患者副損傷同時(shí)也受到大小等方面的限制[17-18]。目前臨床上可應(yīng)用的套管分為自體動(dòng)脈套管和可降解生物型套管。可降解生物型套管材質(zhì)多樣，但作用機(jī)理及效果大致相同。

本研究創(chuàng)新性地應(yīng)用了PEG沖洗動(dòng)脈套管聯(lián)合小間隙縫合法縫合的神經(jīng)斷端，包括電生理學(xué)、行為學(xué)、組織學(xué)在內(nèi)的結(jié)果共同顯示，1mm小間隙動(dòng)脈套管聯(lián)合PEG沖洗可使周圍神經(jīng)離斷損傷后形態(tài)甚至肢體功能恢復(fù)接近正常，效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用PEG及單獨(dú)應(yīng)用動(dòng)脈套管。

本研究未能在更多的時(shí)間點(diǎn)取材并進(jìn)行所述檢測(cè)，也未能完成遠(yuǎn)期大鼠下肢功能恢復(fù)情況的觀察，未能驗(yàn)證PEG應(yīng)用的長(zhǎng)期效果。并且PEG對(duì)于周圍神經(jīng)功能的影響，包括運(yùn)動(dòng)和電生理學(xué)上的影響作用具體到何種程度，其具體作用機(jī)制尚未完全明了；實(shí)驗(yàn)組采用PEG600斷端沖洗，不同分子量及PEG的應(yīng)用方式也未進(jìn)行對(duì)比，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)脈套管為5mm，神經(jīng)斷端保留小間隙1mm，不同的套管長(zhǎng)度及小間隙長(zhǎng)度對(duì)神經(jīng)重建的影響也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。動(dòng)脈套管聯(lián)合小間隙縫合PEG沖洗在體內(nèi)對(duì)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的具體作用以及分子機(jī)制也還需要進(jìn)一步探究。但從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來(lái)看，PEG聯(lián)合動(dòng)脈套管在治療大鼠周圍神經(jīng)損傷上效果明顯優(yōu)于兩者單獨(dú)應(yīng)用，可為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供一種新的思路。