基于AMPK通路降香水提物對急性心肌梗死大鼠心肌細胞線粒體能量代謝的影響

張會濤，郄 濤

（保定市第一中心醫院西院，河北 保定 071000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）屬于嚴重的冠心病類型，在中老年人群中發病率極高，嚴重危害患者生命安全。研究發現，降低炎癥反應和氧化應激水平具有心肌梗死后心臟保護作用[1]。降香（dalbergia odorifera，DO）是一種用于臨床治療心腦血管疾病的中藥。既往研究表明，降香提取物對缺血再灌注導致的心臟損傷具有保護作用，可以降低心肌梗死大鼠心臟炎癥反應[2-3]。另外，通過降低氧化應激水平可以改善心功能[4]。但降香提取物在心肌梗死模型中是否發揮心臟保護作用尚不明確，其具體機制尚不清楚。故本研究通過建立急性心肌梗死模型，探討降香水提物是否通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/過氧化物增殖激活受體γ輔助激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1α，PGC-1α）信號通路降低氧化應激水平、提高心肌能量代謝、改善心功能，以期為降香相關藥物的研發及AMI的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2018-008。飼養期間自由飲食飲水，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，明暗交替。實驗嚴格遵循《實驗動物管理條例》，確保動物福利倫理，經醫學實驗動物管理委員會審核批準，動物倫理福利批準號：BDDYZXYY2019051601。

1.2 藥物與試劑 降香水提物（aqueous extract of dalbergia odorifera，DOA）（純度＞98%，西安小草植物科技有限責任公司，批號：20181206）；5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸轉甲酰酶（5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside,AICAR）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：20190123）；TTC染料（美國Sigma公司，批號：20190322）；單磷酸腺苷（adenosinemonophosphate，AMP）試劑盒（批號：20181007）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）試劑盒（批號：20180815）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）試劑盒（批號：20190412）均購自南京卡米洛生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20180910）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20190405）均購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠AMPK抗體（批號：20180712）、p-AMPK抗體（批號：20180814）、PGC-1α抗體（批號：20190425）、p-PGC-1α抗體（批號：20190321）、GAPDH 抗體（批號：20180911）均購自美國SantaCruz公司。

1.3 主要儀器 RWD407型呼吸機（中國瑞沃德生命科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；電泳儀（北京六一電子儀器廠）；多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.5 造模方法 第7天給藥結束2 h后，除假手術組外，其余各組大鼠建立急性心肌梗死模型。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，連接心電圖機，分離頸部肌肉，暴露氣管，連接呼吸機，輔助呼吸。于第3～4肋間分離皮層、肌肉層，暴露心臟，剪開心包，于肺動脈圓錐與左心耳之間距離主動脈3～4 mm處，6-0號無創縫合線結扎左冠狀動脈前降支。以ST段抬高，左心室前壁變蒼白并持續30 min，為急性心肌梗死模型建造成功。假手術組大鼠僅開胸后，左冠狀動脈前降支相同部位穿線，但不結扎[5]。造模過程中模型組和激動劑+降香水提物組大鼠各死亡2只，其余各組大鼠未死亡。

1.6 觀察指標

1.6.1 心功能 術后第2天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，胸部剃毛，彩色多普勒超聲心動圖檢測各組大鼠左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）。

1.6.2 心肌能量代謝 脫頸處死大鼠，主動脈采血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm。收集上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，加入終止液后，置于酶標儀上，450 nm波長處測定A值，并根據做出的標準曲線，計算血清中ATP、ADP、AMP含量。

1.6.3 心肌梗死面積 剝離心臟，切取心尖部1/2部分，將心尖部橫向切成1～2 mm的薄片，置于1% TTC磷酸緩沖液中，37 ℃恒溫箱孵育20 min，避光并振蕩。之后，用水洗去多余染料，梗死區顯示為灰白色，非梗死區為磚紅色。甲醛固定后掃描，Image pro plus 6.0計算心肌梗死面積百分比=（心肌梗死面積之和/心肌總面積之和）×100%。

1.6.4 心肌組織病理學變化 取部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，經包埋、脫水、切片（片厚4 μm）后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行HE染色，中性樹膠封片后，置于顯微鏡下觀察。

1.6.5 線粒體氧化應激水平 取200 mg心肌組織，置入盛有2mL冰生理鹽水的EP管中，勻漿至無組織塊，4 ℃3 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，收集上清液。SOD活性和MDA含量測定均按照說明書操作。SOD活性測定用黃嘌呤氧化酶法，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，于波長550 nm處測定吸光度（A）值并計算SOD活性，波長532 nm處測定A值并計算MDA含量。

1.6.6 心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α蛋白表達 取部分心肌組織，勻漿后，清洗3次，加入RIPA裂解液靜置30 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min。按照分組依次上樣，每孔加入樣品20 μL，120 V電泳2 h，0.3 A濕轉2 h，TBST洗膜3次，室溫封閉1 h，p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α和GAPDH（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J軟件計算條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

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1.7 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計量資料以（）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 模型組大鼠LVEF和LVFS均低于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），而高于激動劑組（P＜0.05）；模型組大鼠LVEDD和LVESD均長于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），而短于激動劑組（P＜0.05）。激動劑+降香水提物組大鼠LVEF和LVFS均低于降香水提物組（P＜0.05），而高于激動劑組（P＜0.05）；激動劑+降香水提物組大鼠LVEDD和LVESD均長于降香水提物組（P＜0.05），而短于激動劑組（P＜0.05），提示模型組大鼠心功能障礙，DOA可改善心功能。（見表1）

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動劑組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP含量比較 模型組大鼠血清ATP含量低于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），高于激動劑組（P＜0.05），而ADP、AMP含量均高于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），低于激動劑組（P＜0.05）。激動劑+降香水提物組大鼠血清ATP含量低于降香水提物組（P＜0.05），高于激動劑組（P＜0.05），而ADP、AMP含量均高于降香水提物組（P＜0.05），低于激動劑組（P＜0.05）。提示模型組大鼠線粒體能量代謝障礙，DOA可提高線粒體能量代謝。（見表2）

表2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP 含量比較（，μg/L）

表2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP 含量比較（，μg/L）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動劑組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較 假手術組大鼠心肌未見梗死區域，模型組大鼠心肌梗死明顯；降香水提物組大鼠心肌梗死面積明顯小于模型組（P＜0.05）；激動劑組大鼠心肌梗死面積明顯大于模型組（P＜0.05）；激動劑+降香水提物組心肌梗死面積大于降香水提物組（P＜0.05），而小于激動劑組（P＜0.05）。提示降香水提物可減小心肌梗死面積。（見表3、圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織TTC 染色圖

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較（）

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與降香水提物組比較，bP＜0.05；與激動劑組比較，cP＜0.05

2.4 各組大鼠心肌組織病理學改變情況 假手術組大鼠心肌細胞排列整齊致密，間質無水腫；模型組和激動劑組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，肌纖維斷裂，間質水腫，且激動劑組較模型組病變嚴重；降香水提物組大鼠心肌細胞病變減輕，趨于正常；激動劑+降香水提物組大鼠心肌細胞病變較降香水提物組加重，較激動劑組減輕。（見圖2）

圖2 各組大鼠心肌組織病理改變圖（HE，×400）

2.5 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD活性比較 模型組大鼠心肌組織中MDA含量高于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），而低于激動劑組（P＜0.05），SOD活性低于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），而高于激動劑組（P＜0.05）；激動劑+降香水提物組大鼠MDA含量高于降香水提物組（P＜0.05），而低于激動劑組（P＜0.05），SOD活性低于降香水提物組（P＜0.05），而高于激動劑組（P＜0.05）。提示DOA能降低心肌梗死大鼠氧化應激水平。（見表4）

表4 各組大鼠心肌組織中MDA 含量和SOD 活性比較（）

表4 各組大鼠心肌組織中MDA 含量和SOD 活性比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動劑組比較，dP＜0.05

2.6 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α及PGC-1α蛋白表達比較 5組大鼠心肌組織中AMRK、PGC-1α蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。模型組大鼠心肌組織中p-AMPK和p-PGC-1α蛋白相對表達量均高于假手術組和降香水提物組（P＜0.05），而低于激動劑組（P＜0.05）；激動劑+降香水提物組大鼠心肌組織中p-AMPK、p-PGC-1α蛋白相對表達量均高于降香水提物組（P＜0.05），而低于激動劑組（P＜0.05）。提示DOA能抑制心肌梗死大鼠心肌組織中AMPK/PGC-1α信號通路。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α 蛋白表達Western blotting 圖

表5 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α 和PGC-1α 蛋白表達比較（）

表5 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α 和PGC-1α 蛋白表達比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動劑組比較，dP＜0.05

3 討論

AMI常見于動脈粥樣硬化斑塊破裂，動脈粥樣硬化斑塊破裂造成急性冠狀動脈栓塞，限制或阻斷血液回流入心臟，引起心肌細胞缺血缺氧，造成心肌細胞死亡，心肌細胞的喪失和心肌纖維化導致心臟收縮和舒張功能障礙，最終導致心力衰竭。線粒體為主要的能量合成場所，由于心肌細胞缺氧和缺少營養物質的供應，線粒體功能障礙，ATP產生異常，活性氧生成過度，導致心肌細胞氧化應激水平升高[7-8]。降香通過降低氧化應激水平，抑制細胞衰老進程[9]。降香能激活HO-1降低炎癥反應，對伴有小膠質細胞激活的神經退行性疾病具有改善作用[10]。冠心丹參方主要成分包括降香、丹參、三七，研究發現，冠心丹參方可有效拮抗糖尿病心肌病[11]。本研究的目的在于探討降香水提物是否對AMI大鼠具有心臟保護作用，并探討其作用機制。

本研究通過預先灌胃DOA，再進行左冠狀動脈結扎的方法建立AMI大鼠模型，以探討DOA的作用。實驗結果表明，AMI大鼠LVEF、LVFS降低，LVEDD、LVESD增長，心功能下降，同時心肌梗死面積明顯增加，服用DOA的大鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD縮短，心肌梗死面積減少，提示DOA可改善AMI大鼠心功能。大鼠發生AMI時，線粒體能量代謝異常，ATP合成降低，ADP、AMP合成增加。本研究結果顯示，DOA可使AMI大鼠心肌線粒體ATP合成增加，ADP、AMP降低，改善線粒體功能障礙。

AMPK廣泛存在于真核細胞，可降低結腸炎小鼠模型炎癥反應，減輕腸道損傷，增強衰老大鼠模型神經元細胞自噬改善腦功能下降。雷諾拉嗪可通過抑制AMPK信號通路降低炎癥反應和氧化應激水平，減輕異丙腎上腺素誘導的心肌損傷程度。胡蘆巴苷牡荊可通過調節AMPK/ACC通路改善肥胖誘導的糖尿病腎病[12-15]。研究發現，鹽酸小檗堿可通過AMPK信號通路降低糖尿病腎病大鼠血糖水平，增強SOD活性，降低MDA水平，改善腎功能[16]。此外，AMPK還可以調節機體和細胞能量代謝[17]。PGC-1α是細胞代謝的中樞調節因子，AMPK/PGC-1α信號可通過參與調節線粒體生物合成和能量代謝，降低氧化應激水平，改善線粒體功能障礙[18-19]。本研究中，大鼠發生AMI時，由于心肌細胞缺乏營養物質和缺氧，AMPK/PGC-1α信號通路被激活，p-AMPK和p-PGC-1α蛋白表達增加。降香水提物是否能調節該信號通路仍需進一步研究。本研究通過AMI大鼠腹腔注射信號通路激動劑AICAR，同時灌胃DOA，探討兩者之間的相互關系。結果表明，DOA可降低p-AMPK、p-PGC-1α蛋白表達，表明DOA可以調節AMPK/PGC-1α信號通路。

綜上所述，DOA可降低AMI大鼠氧化應激水平，增強線粒體能量合成，改善AMI大鼠心功能障礙，可能是通過調節AMPK/PGC-1α信號通路發揮調控作用。