山苓荷甘酵素發酵前后降血脂及降血糖藥效的對比研究*

劉 斌，瞿昊宇，陳光宇，謝夢洲

（1.湖南省藥食同源功能性食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎原料，經乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發酵而使原材料生物活性增強或產生新的生物活性的物質[1]。關于酵素的研究最早于20世紀初起源于日本，后來發展到歐美地區，成為了成熟的產業，有上千萬消費者每天服用酵素產品[2]。近30年來，中國人群的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加。2012年全國調查結果顯示[3]，中國成人血脂異常總體患病率高達40.40%，較2002年呈大幅度上升[4]。高脂血癥是導致動脈粥樣硬化進而形成心腦血管事件的主要因素之一，有效防治血脂異常是預防心腦血管疾病的重要途徑[5-8]。目前的治療藥物對肝臟有一定損害及副作用，故不適合長期服用，患者順應性差。因此選取藥食同源中藥,開發具有防治高脂血癥的保健食品具有廣闊的市場前景和重要的社會意義。山苓荷甘酵素處方來自湖南中醫藥大學中醫藥膳學及藥食同源功能性食品研究專家謝夢洲創制的藥食同源中醫藥膳方[9]，由山楂、山藥、茯苓、荷葉、甘草5味具有降血脂作用的藥食同源中藥組成，經提取、濃縮、植物乳酸桿菌發酵、干燥制成。前期研究[3]發現本方中具有降血脂作用的多糖類成分發酵后含量明顯高于發酵前，而同樣具有降血脂作用的總黃酮、荷葉堿、金絲桃苷、熊果酸幾種成分發酵前后含量變化不明顯，發酵過程對降血脂藥效的影響無法僅從測定降血脂活性成分的含量結果推斷。為闡明發酵對降血脂藥效的影響及發酵的意義，本研究選用高脂高糖模型SD大鼠對山苓荷甘酵素發酵前低劑量（臨床劑量）和中劑量（臨床劑量×2）與發酵后低劑量和中劑量進行降血脂藥效（TC、TG、LDL-L、HDL-C）及降血糖（GLU）藥效比較，現報告如下。

1 材 料

1.1 動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2020-0002。實驗動物質量合格證號：1107271911005758，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004；在湖南省藥物安全評價研究中心屏障環境飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2015-0016。實驗期間環境溫度20～26℃，濕度40%～70%。

1.2 材料與試劑 辛伐他汀片（批號：201006，默沙東公司）；山楂（批號：191203831）、荷葉（批號：20200510）、甘草（批號：20200105）、山藥（批號：191204751）、茯苓（批號：20191226）藥材飲片均購自康美藥業股份有限公司，經王智教授鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》有關規定；植物乳酸桿菌CICC21790（中國工業微生物菌種保藏管理中心）；MRS肉湯培養基BS1137（杭州百思生物技術有限公司）；山苓荷甘酵素發酵前后4個樣品由本實驗室制備。GLU測定試劑盒（批號：208085）、TG測定試劑盒（批號：205015）、TC測定試劑盒（批號：208074）、LDL-C試劑盒（批號：208085）、HDL-C試劑盒（批號：208093）均購自日本和光純藥工業株式會社。

1.3 儀器與設備 IMaik酶標儀（伯樂生命醫學產品上海有限公司）；ATX124型電子天平（東京島津儀器有限公司）；HTP-312型電子天平（上海花潮電器有限公司）；LABOSPECT003型自動生化分析儀（美國MD公司）。

2 實驗方法

2.1 山苓荷甘提取物和酵素的制備方法 山苓荷甘提取物的制備：山楂、荷葉、甘草混勻，加入70%乙醇浸泡后回流提取2次，分別過濾，合并2次濾液[10]，50 ℃減壓濃縮至無醇味；山藥、茯苓混勻，加水浸泡1 h，提2次，分別過濾，濾液與醇提濃縮液合并[11]，50 ℃減壓濃縮至每1 mL相當于藥材2 g，-80 ℃冰箱保存。山苓荷甘酵素的制備：提取濃縮方法同山苓荷甘提取物，將每1 mL相當于藥材2 g的濃縮液121 ℃滅菌25 min，無菌條件下在滅菌液中加入2%的雙歧桿菌菌粉，在37 ℃培養72 h發酵，發酵液置-80 ℃冰箱保存[12-13]。

2.2 動物分組及給藥劑量 將70只SPF級健康成年雄性SD大鼠按體質量隨機分為7組：山苓荷甘發酵前中、低劑量組，山苓荷甘發酵后中、低劑量組，空白對照組，高脂血癥模型組，辛伐他汀陽性對照組，每組10只。高脂血癥模型組及山苓荷甘發酵前后各劑量組大鼠給予高脂飼料（78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽），并按5 mL/kg劑量給予生理鹽水。山苓荷甘發酵前后低劑量組大鼠分別按2.5 mL/kg（相當于給藥量5 g/kg）給予相應的藥液灌胃，山苓荷甘發醇前后中劑量組大鼠分別按5 mL/kg（相當于給藥量10 g/kg）給予相應的藥液灌胃，辛伐他汀陽性對照組大鼠灌胃量為5 mg/kg，空白對照組按5 mL/kg劑量給予生理鹽水。

2.3 造模與給藥 大鼠常規飼養1周，禁食12 h，眼眶采血2 mL，檢測基礎血脂，造模前各組大鼠血脂比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。1周后開始高脂飼料（78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉和10%豬油、0.2%膽鹽）造模，自正式實驗開始，除空白對照組喂基礎飼料，其余各組大鼠換用高脂飼料喂養10 d，禁食12 h，眼眶采血2 mL，測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、葡萄糖（GLU）。與喂飼高脂飼料前比較，TC、TG、GLU顯著升高（P<0.05），可確定已形成高脂血癥模型。造模第11天開始大鼠灌胃，連續給藥30 d，各組大鼠均自由飲水和進食。空白對照組大鼠給藥期間喂基礎飼料，其余各組大鼠給藥期間繼續喂高脂飼料。

2.4 觀察指標 末次給藥后禁食12 h以上，麻醉后從腹主動脈取血，放置2 h，凝固后3 000 r/min離心15 min。血樣離心后取上層血清，按照試劑盒說明書采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA），往預先包被TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU抗體的包被微孔中依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），代入各項指標的標準曲線回歸方程中計算各項指標的濃度。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0分析數據，各組每只大鼠每項指標所有數據先通過狄克松法（Dixson）、格拉布斯法（Grubbs）、指數分布樣本法及專業知識進行異常值檢驗，舍去異常值，再進行正態性檢驗（Shapiro—Wilk），皆滿足正態性（P＞0.05），采用完全隨機單因素試驗方差分析及LSD法進行兩兩比較。

3 結果

（1）血清TC：高脂血癥模型組大鼠血清TC與空白對照組比較，差異無統計意義（P＞0.05），表明造模不成功，實驗誤差太大，導致結果異常。

（2）血清TG：山苓荷甘發酵前中、低劑量組，山苓荷甘發酵后中、低劑量組，高脂血癥模型組，以及辛伐他汀陽性對照組大鼠血清TG均高于空白對照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發酵前中、低劑量組，山苓荷甘發酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽性對照組大鼠血清TG與高脂血癥模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明辛伐他汀，發酵前中、低劑量山苓荷甘酵素，以及發酵后中、低劑量山苓荷甘酵素均無降低TG的藥效。

（3）血清HDL-L：高脂血癥模型組大鼠血清HDL-L與空白對照組比較，差異無統計意義（P＞0.05），表明造模不成功，實驗誤差太大，導致結果異常。

（4）血清LDL-C：高脂血癥模型組大鼠血清LDL-C高于空白對照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發酵后中劑量組、辛伐他汀陽性對照組大鼠血清LDL-C均低于高脂血癥模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明發酵后中劑量山苓荷甘酵素、辛伐他汀均可有效地降低高脂血癥大鼠血清LDL-C；而其他各組大鼠血清LDL-C與模型組比較，差異均無統計意義（P＞0.05），表明無降低LDL-C作用。

（5）GLU：高脂血癥模型組大鼠血清GLU高于空白對照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發酵前中、低劑量組，山苓荷甘發酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽性對照組大鼠血清GLU均低于高脂血癥模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；山苓荷甘發酵前中、低劑量組，山苓荷甘發酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽性對照組大鼠血清GLU與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明辛伐他汀，發酵前中、低劑量山苓荷甘酵素，以及發酵后中、低劑量山苓荷甘酵素均有降低GLU的藥效，且能降低大鼠血清GLU至空白對照組水平。（見表1）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比較（，ng/L）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比較（，ng/L）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與高脂血癥模型組比較bP＜0.05

4 討論

本實驗結果表明，山苓荷甘發酵后中劑量組和辛伐他汀陽性對照組有降低LDL-C的作用，即具有降血脂作用；辛伐他汀陽性對照組，山苓荷甘發酵前低、中劑量組，以及山苓荷甘發酵后低、中劑量組均有降低GLU的作用，即這5組皆具有降低血糖的作用。

本實驗方法系參照國家食品藥品監督管理局2014年下發的保健食品9個功能檢驗方法中附件6輔助降血脂功能評價方法，“用含有膽固醇、蔗糖、豬油、膽酸鈉的飼料喂養動物可形成脂代謝紊亂動物模型，再給予動物受試樣品，可檢測受試樣品對高脂血癥的影響，并可判定受試樣品對脂質的吸收、脂蛋白的形成、脂質的降解或排泄產生的影響”。

TC測定數據中空白對照組與高脂血癥模型組比較，差異無統計意義（P＞0.05），表明造模不成功，實驗誤差太大，導致結果異常，故本實驗相當于探索性的預實驗。本實驗結果表明山苓荷甘發酵后的降血脂作用優于不發酵，發酵工序不可缺少，下一步按保健食品研究與開發進行功能試驗時，必須在第三方認證機構進行實驗，以減少操作誤差。