基于SIRT1/ROR-γt通路探討白藜蘆醇對銅綠假單胞菌誘導的免疫抑制肺炎小鼠的治療作用*

羅勁松 夏利平 劉宏

(武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，是醫院獲得性感染和肺部感染的主要致病菌之一[1]。銅綠假單胞菌耐藥性強，耐藥譜廣，感染后難以清除，易形成慢性感染，為臨床治療帶來巨大困難。沉默信息調節蛋白1(silent information regulator protein 1，SIRT1)屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸(nicotinemide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的類組蛋白去乙酰化酶[2]。SIRT1通過去乙酰化調節下游通路，在炎癥、細胞存活等過程中發揮重要作用[3]。核孤兒受體-γt(ROR-γt)與炎癥有關，當ROR-γt缺陷時，組織浸潤和募集炎癥細胞能力降低，炎癥性疾病癥狀減輕[4]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是最初從藜蘆花中分離得到的酚類物質，存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物，具有抗炎、調節免疫等多種藥理學作用[5-7]。據研究，白藜蘆醇可通過調節SIRT1介導的信號通路參與抗炎反應的保護因子[8]。魏晶等[9]研究發現，白藜蘆醇能夠促進哮喘幼鼠肺組織中SIRT1的表達，從而減輕炎癥反應。但目前關于白藜蘆醇對免疫抑制肺炎小鼠的治療作用與SIRT1表達是否有關，尚未見相關報道。本研究通過建立銅綠假單胞菌誘導的免疫抑制肺炎小鼠模型，探究白藜蘆醇的藥效作用以及與SIRT1/RORγt通路的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雌性BALB/c小鼠，體重25～35g，購自廣州醫科大學，許可證號：SYXK(粵)2020-0227，實驗遵守3R原則。

1.2 主要試劑 白藜蘆醇(>98%，批號：ZL2017851 42144，東明格魯斯生物科技有限公司)。環磷酰胺(CTX)(批號：18022625，江蘇盛迪醫藥有限公司)。IL-17 ELISA試劑盒(ab100702)，SIRT1(ab54334)、ROR-γt(ab268112)、DAPDH(ab222428)一抗及二抗(貨號：ab150077)購自英國Abcam公司。伊紅蘇木精試劑盒(貨號：C0105)、蛋白提取試劑盒(貨號：P0028)、BCA試劑盒(貨號：P0012)購自上海碧云天公司。總RNA提取試劑盒(DP431)購自北京天根生化科技有限公司。反轉錄試劑盒(RR023A)、熒光定量PCR試劑盒(RR086A)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.3 實驗儀器 熒光定量PCR儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司，轉膜儀購自美國Invitrogen公司，凝膠成像儀購自杭州Miulab公司，光學顯微鏡購自德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 銅綠假單胞菌肺炎小鼠動物模型建立及動物分組 將90只小鼠隨機分為空白組、PA組、免疫抑制組、免疫抑制+PA組及免疫抑制+PA+白藜蘆醇組(依次命名為A、B、C、D、E組)，每組各18只。所有動物均飼養于無菌動物房，給予無菌飼料及無菌水喂養。經過一周適應性飼養后，如先前所述[10]，經過一定修改后于實驗第1、3、5天腹腔注射環磷酰胺150mg/kg，建立免疫抑制模型，對照組腹腔注射等量無菌PBS液。于實驗第6天，在小鼠每側鼻孔滴入10μL PA懸液(1×109CFU/mL)，將小鼠豎立30s左右，保證菌液在肺部均勻分布，建立PA模型(對照組給予等量無菌PBS液)。二者結合建立免疫抑制+PA模型。根據李明等[11]研究結果，使用無菌生理鹽水將白藜蘆醇配置成25μmol/L的濃度，在免疫抑制+PA模型建立后立即以10mL/kg白藜蘆醇的劑量腹腔注射，即為免疫抑制+PA+白藜蘆醇組。本研究符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核批準。

1.4.2 樣本采集 各組小鼠于造模成功后4、8及24h后分批處死，每組每個時間點隨機選取6只。小鼠經過量麻醉后處死，經眼眶收集外周血1mL左右，離心收集血清，置于-80℃中保存備用。完整取出小鼠肺組織，左肺置于甲醛中固定，右肺液氮速凍后，置于-80℃中保存。

1.4.3 外周血IL-17濃度檢測 取各個時間點的凍存血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-17濃度，每個標本設置3個復孔，酶標儀讀取各孔吸光度(OD450)，取平均值。

1.4.4 肺組織病理學檢測及評分 取出各個時間點固定在甲醛中的小鼠肺組織，經過包埋、切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察病理學變化，并根據急性肺損傷評分標準，從肺內毛細血管淤血、肺泡腔纖維蛋白滲出、中性粒細胞浸潤、氣道黏膜上皮脫落、肺泡間隔增寬等5方面，按病變程度分為5級評分，0分：無，1分：可疑，2分：輕度，3分：明顯，4分：重度改變。

1.4.5 qRT-PCR檢測SIRT1、RORγt mRNA表達水平 用Trizol法提取24h時間點各組小鼠肺組織總RNA，使用Nanodrop檢測RNA濃度及純度，然后使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，進行qRT-PCR檢測。使用primer premier 5.0軟件設計熒光定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR的反應條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，共40個循環；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。其中，以GADPH為內參基因。

表1 SIRT1、RORγt、GADPH引物序列

1.4.6 Western blot法檢測SIRT1、RORγt蛋白表達水平 選取24h時間點各組小鼠，提取肺組織總蛋白，Western blot檢測SIRT1、RORγt蛋白表達水平，以GAPDH為內參蛋白。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對外周血IL-17濃度的影響 在同一時間進行比較，結果發現各個時間點，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠血清中IL-17含量均顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠血清中IL-17含量均顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組血清中IL-17含量均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 血清中IL-17檢測結果

2.2 白藜蘆醇對肺組織病理學的影響 HE染色后，光學顯微鏡下可觀察到，空白組各時間點肺泡結構完整，肺泡腔內無明顯滲出物和炎性細胞浸潤，肺泡間隔均一，無出血和水腫。免疫抑制組肺泡結構較為完整，部分有少許炎性細胞浸潤。PA組和免疫抑制+PA組肺泡結構嚴重破壞，肺泡內可見大量中性粒細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡隔增厚，增寬。白藜蘆醇處理組肺組織的病理癥狀減輕，且隨著時間的增加，癥狀越來越輕，見圖1。

圖1 24h時間點小鼠肺組織HE染色結果(100×)

2.3 白藜蘆醇對肺組織病理學評分的影響 與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織病理學評分顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織病理學評分顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織病理學評分顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠肺組織病理學評分

2.4 白藜蘆醇對SIRT1、RORγt mRNA表達水平的影響 造模成功后24h，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織RORγt mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織RORγt mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 24h時間點各組小鼠SIRT1、RORγt mRNA表達水平

2.5 白藜蘆醇對SIRT1、RORγt蛋白表達水平的影響 造模成功后24h，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織RORγt蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織RORγt蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表5。

表5 24h時間點各組小鼠SIRT1、RORγt蛋白表達水平

圖2 24h時間點各組小鼠SIRT1、RORγt蛋白WB檢測結果

3 討論

PA是引起醫院獲得性肺炎最常見的革蘭氏陰性菌之一[12]，生長繁殖所需營養條件低，抵抗力強，耐藥性強。當PA感染機體后，機體會啟動自身免疫機制，釋放相應的炎癥介質，促進機體的炎癥和損傷。TH17細胞是新發現的一類CD4+T細胞亞群，能通過分泌IL-17等細胞炎癥因子激活機體炎癥反應[13-14]。IL-17作為Th17細胞特異性細胞分子，通過結合Act1、TRAF6等受體而促進多種趨化因子及基質蛋白分泌，招募大量中性粒細胞聚集，引起炎性反應，導致組織器官的炎性損傷[15-16]。環磷酰胺為臨床上常用免疫抑制藥物，能夠影響機體免疫反應，造成機體免疫功能低下。本研究使用環磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，并在此基礎上制備PA感染肺炎模型，可觀察到肺炎小鼠毛發紊亂，行動緩慢，反應遲鈍，呼吸急促，采食量減少，鏡下可見PA組和免疫抑制+PA組小鼠肺組織損傷嚴重，肺泡結構被破壞，同時大量中性粒細胞和炎性細胞浸潤，肺泡壁增寬、充血，小鼠肺組織病理學評分及血清中IL-17的含量顯著升高，表明PA感染免疫抑制小鼠，小鼠肺組織的病理變化嚴重，炎癥反應明顯，揭示小鼠模型建立成功。

白藜蘆醇是一種天然植物多酚，具有廣泛的藥理活性，在抗炎癥方面效果顯著。黃曉軍等[17]研究發現，白藜蘆醇可降低急性肺損傷模型小鼠血清中促炎癥介質水平，從而減輕急性肺損傷的炎癥程度。李明等[11]研究發現，白藜蘆醇可以抑制呼吸道合胞病毒所致的信號通路激活，從而減輕炎癥反應，發揮對肺損傷的保護作用。本研究發現，PA誘導的免疫抑制肺炎小鼠經白藜蘆醇處理后，小鼠肺組織病理癥狀減輕，中性粒細胞和炎性細胞減少，肺組織病理學評分和血清中IL-17的含量顯著降低，且隨著時間增加，癥狀減輕更明顯，表明白藜蘆醇可減輕PA誘導的免疫抑制肺炎小鼠的肺組織病變，減輕炎癥反應，且隨著時間的增加，效果更顯著。

SIRT1為廣泛存在于哺乳動物NAD+依賴的去乙酰化酶，與炎癥反應有關。RORγt是TH17細胞分化過程中的關鍵轉錄因子，抑制RORγt表達可直接抑制未致敏T細胞向TH17細胞分化，進而降低TH17細胞水平，減輕炎癥反應[18-19]。本研究結果顯示，與空白組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt mRNA和蛋白表達水平顯著升高，SIRT1mRNA和蛋白表達水平顯著降低，表明上調RORγt蛋白，下調SIRT1蛋白，可能與小鼠炎癥反應增強有關，加劇小鼠肺組織損傷。白藜蘆醇為去乙酰化酶SIRT1最有效的激活劑之一，具有明顯促進SIRT1激活作用[20]。李傳文等[21]研究發現，白藜蘆醇使SIRT1激活可促進腦缺血再灌注大鼠的神經功能缺損恢復，減輕炎癥反應。李方等[8]研究發現，白藜蘆醇可明顯提高大鼠腎組織SIRT1蛋白表達水平，減輕炎癥反應。本研究中，免疫抑制+PA組小鼠經過白藜蘆醇處理后，RORγt的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，SIRT1mRNA和蛋白表達水平顯著升高，表明白藜蘆醇可促進SIRT1表達，抑制RORγt表達，進而抑制未致敏T細胞向TH17細胞分化，降低TH17細胞水平，減輕炎癥反應，發揮保護作用。

4 結論

本研究結果顯示，白藜蘆醇可能通過上調SIRT1表達，下調RORγt表達，抑制炎癥反應，減輕銅綠假單胞菌免疫抑制肺炎小鼠肺組織損傷，保護肺組織，為臨床治療PA肺炎提供了新思路，但其具體作用機制仍需進一步研究。