紫草素對大鼠鼻黏膜機械性損傷的修復作用*

胡盛琳 晏小蓉 黃翔悅 張雪娟

(1.雅安市人民醫院，四川 雅安 625000；2.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130)

鼻粘膜損傷主要由外傷、放射治療、慢性感染(鼻竇炎或鼻竇手術術后感染)、變態反應及藥物損傷等多種因素引起。主要表現為鼻腔黏膜，黏膜下組織充血腫脹等癥狀，嚴重時導致并發癥，如粘連癥、骨炎或纖維化，額竇炎等[1-3]。鼻損傷或鼻部創面愈合的術后處理常使用鼻腔噴霧劑、鼻腔填塞劑、給予抗生素或糖皮質激素等藥物。中藥在治療各種鼻損傷或促進鼻黏膜創面愈合中也扮演著重要角色[1,4]。紫草素是紫草的主要活性成分，屬于萘醌類化合物[5]。藥理學研究顯示，紫草素有抗氧化、抗血栓、抗炎、抗菌和促進傷口愈合作用，能顯著改善關節炎外觀和減少軟骨破壞；在急性潰瘍性腸炎誘導的小鼠模型中，紫草素可改善糞便外觀，防止血便和結腸、直腸縮短，改善增重[6]。紫草素及其衍生物體外抗菌活性顯示，其對甲氧西林敏感和耐藥金黃色葡萄球菌、萬古霉素敏感和耐藥糞腸球菌具有較強抗菌活性[7]。本研究以SD大鼠鼻黏膜機械損傷模型為對象，觀察了紫草素對鼻黏膜損傷的修復作用，旨在為該藥應用于各種鼻炎及鼻腔術后黏膜快速修復和保健提供理論依據。

1 實驗與方法

1.1 藥物與主要試劑 紫草素采用超聲輔助乙醇提取法從新疆紫草干燥根提取，采用堿提酸沉淀法純化獲得，純度 ≥96%；紫草素溶液配制用0.5%二甲基亞砜做溶劑；紅霉素軟膏，規格：1%×10g，為上海通用藥業股份有限公司產品；氯化鈉等試劑購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實驗動物 60只SD大鼠，SPF級，6～8周齡，體重180～220 g，雌雄各半，購自成都達碩生物科技有限公司，動物生產許可證號：scxk(川)2015-030，實驗前在標準化實驗動物房適應性飼養1周。大鼠處理符合實驗動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核批準。

1.3 大鼠鼻黏膜機械性損傷模型的制備及分組給藥 將鼻部健康的SD大鼠用乙醚麻醉后，用手固定大鼠鼻部，酒精消毒后用刮匙在鼻甲中部鼻中隔面由后至前刮5次，傷及黏膜及黏膜下組織，但不傷及軟骨[8-9]。以鼻黏膜出血、血痂、紅腫、血管擴張，以及顯微鏡觀察為黏膜上皮細胞及纖毛排列紊亂，充血、水腫為鼻黏膜損傷的判斷標準[10]。將60只SD大鼠按隨機數字表法分為五組，每組各12只，分別為紫草素高(4 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低劑量組(1 mg/kg)，陽性藥物對照組(紅霉素軟膏)及模型對照組。每組大鼠鼻黏膜造成機械性損傷消毒后，立即使用藥物處理。紫草素組大鼠鼻腔按相應給藥劑量給予紫草素溶液滴鼻；陽性藥物對照組大鼠鼻腔涂抹0.1m紅霉素軟膏(使用10μL槍頭吸取軟膏輕輕涂抹鼻腔)；模型對照不作任何處理。每天在固定時間給藥，連續用藥21天。

1.4 指標觀察 用藥后每天觀察每組動物的精神狀態，飲食情況及鼻部癥狀。在給藥第7、14、21天時從每組中分別隨機抽取4只動物，乙醚麻醉后，耳內鏡觀察鼻腔黏膜形態后處死動物，剝離其頭部皮膚、肌肉，用眼科剪將鼻腔上方的骨骼分離，將鼻甲、鼻中隔充分暴露于視野，隨后將鼻中隔兩側的鼻粘膜輕輕剝離后取出，置于4%多聚甲醛固定24h后脫水，石蠟包埋，常規石蠟切片，HE 染色，光學顯微鏡200倍下觀察組織病理學變化。在400倍下，每個樣本選取三個視野拍照，隨后運用Image pro plus軟件分別對鼻腔上皮、固有層進行中性粒細胞、淋巴細胞計數。

2 結果

2.1 實驗大鼠一般情況、鼻部表現特征情況及鼻黏膜組織病理學情況 不同組別大鼠在不同時間點的一般情況、鼻部表現特征情況及鼻黏膜組織病理學情況比較,見表1。在不同觀察時間點各組大鼠鼻黏膜組織病理學圖片,見圖1。

圖1 在實驗第7天、14天 和21天時各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察(400×)

表1 不同組別大鼠在不同時間點的一般情況、鼻部表現特征情況及鼻黏膜組織病理學情況比較

2.2 大鼠鼻粘膜上皮中性粒細胞及淋巴細胞計數情況 第14天紫草素低劑量組及中劑量組鼻黏膜中性粒細胞計數與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)，其余時間點鼻黏膜中性粒細胞計數模型組與紫草素不同劑量組組間相比較差異均有統計學意義(P<0.05)；在第14d紫草素低劑量組及中劑量組鼻黏膜淋巴細胞與模型組相比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余時間點模型組與紫草素不同劑量組間相比較差異均有統計學意義(P<0.05)；陽性組與紫草素不同劑量組中性粒細胞計數及淋巴細胞計數組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；不同劑量紫草素組在不同觀察時間中性粒細胞計數及淋巴細胞計數組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且紫草素劑量越高，觀察到的大鼠鼻黏膜上皮的中性粒細胞計數及淋巴細胞計數越低。

3 討論

鼻黏膜損傷可能是炎癥刺激，手術等外傷造成，在病理情況下，主要表現為纖毛排列紊亂、部分脫落，固有層增生和炎性細胞浸潤等變化[1,3]。鼻黏膜損傷模型制備主要有鼻黏膜輻射損傷模型[4，11]；藥物性，如減充血劑導致鼻黏膜損傷[9]；大氣顆粒PM10造成鼻黏膜急性損傷[12]。本次采用刮匙在SD大鼠鼻黏膜反復劃刮制備鼻黏膜機械性損傷模型[10,13]。結果表明，該模型制備操作簡單，安全，不會導致實驗動物死亡。在整個實驗期間，均能觀察到模型組大鼠鼻黏膜的損傷，如紅腫、血管充血、出血和潰瘍，以及柱狀上皮細胞變性壞死，纖毛倒伏，白細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤的病理變化。以上說明機械損傷可以作為制備鼻黏膜損傷模型的常規方法，可在實驗室推廣應用。

紫草為我國傳統中藥，始載于《神農本草經》，是紫草科植物(新疆紫草、滇紫草或蒙紫草)的干燥根。性味甘、咸、寒，歸心、肝經。功效清熱涼血、透疹消斑、活血解毒。主治血熱毒盛，斑疹、麻疹不透，濕疹，瘡瘍，燙傷等[14]。紫草素為紫草最主要活性成分，現代藥理學研究限制紫草素及其衍生物具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等廣泛藥理活性[8]。紫草素抗炎作用研究顯示了紫草素通過抑制毛細血管擴張，降低通透性，減少滲出、緩解炎性腫脹，對急性和亞急性炎性動物模型有顯著抗炎作用，呈明顯的劑量-效應關系，其高劑量(4mg/kg)組抗炎效果與地塞米松一致[15]。本研究前曾觀察了不同劑量紫草素對小鼠熱水甩尾潛伏期、小鼠熱板痛閾值的影響，以及對二甲苯所致小鼠耳腫脹、小鼠瓊脂肉芽腫、醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響。前期研究顯示紫草素具有明顯的鎮痛和抗炎作用(實驗結果尚未發表)。基于紫草素明顯的鎮痛、抗炎活性，本研究觀察了紫草素對SD大鼠鼻黏膜損傷的修復作用。

表2 不同組別大鼠鼻黏膜上皮在不同觀察時間中性粒細胞及淋巴細胞計數情況比較

研究結果顯示，在實驗第7天，不同劑量紫草素均能改善鼻損傷SD大鼠臨床表現，具體表現為用藥后大鼠鼻孔流血，流涕和抓撓鼻部現象消失，效果與紅霉素表現一致。大鼠鼻部檢查可見，紫草素對鼻粘膜損傷的修復作用與劑量、用藥時間有關。中、高劑量在實驗第7天鼻粘膜腫脹有改善，且沒有明顯的黏膜破損或潰瘍；第21天時，除低劑量(1mg/kg)組除1只大鼠鼻黏膜有炎癥反應外，中、高劑量組大鼠鼻黏膜均恢復正常。

大鼠鼻黏膜組織病理學檢查結果顯示，紫草素對鼻損傷大鼠鼻黏膜上皮及固有膜的修復也與劑量、用藥時間相關。紫草素中、高劑量能明顯改善受損鼻黏膜，主要表現為黏膜柱狀上皮排列致密、整齊，固有膜充血、出血減少，炎性細胞浸潤得到改善。鼻黏膜炎癥區域中性粒細胞、淋巴細胞計數顯著或極顯著低于模型對照組，也符合病理切片觀察結果。尤其在后期(第21天)，紫草素對損傷鼻黏膜的改善和修復作用更為明顯，幾乎達到抗生素(紅霉素)的效果。以上說明了紫草素對鼻黏膜機械性損傷修復有明顯改善作用，且與藥物劑量、用藥時間有關。

紫草素及其衍生物抗炎作用是通過抑制細胞ERK磷酸化，下調NF-κB活化，抑制iNOs蛋白表達發揮抗炎作用；也可通過TLR4/NF-κB信號通路，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NO分泌，促進IL-10分泌；降低巨噬細胞中高遷移率族蛋白表達，或干擾NF-κB-P65的核轉移，抑制炎癥反應；抑制IL-22介導的角質形成細胞分泌S100A7、S100A8等促炎因子的釋放，從而減輕炎癥反應[8,14,16]。

紫草素能促進皮膚創傷愈合，主要在于抑制炎癥反應，促進細胞增殖，和抑制瘢痕形成等方面發揮作用[17]。Chia Yen Hsiao等發現紫草素能使細胞增殖率達25%以上。蛋白組學研究發現，紫草素處理后的成纖維細胞顯示出抗氧化活性、抗凋亡活性，它還能調節細胞遷移、使細胞分泌膠原蛋白、以及去除異常蛋白、促進細胞增殖等。動物模型也證實紫草素能加速SD大鼠側背創面的愈合[18-20]。梁鞏等用紫草素凝膠涂抹驢皮膚傷口，在實驗第11天用藥組傷口收縮率、表皮上皮化顯著高于模型對照組，且皮膚組織排列整齊。他們還發現紫草素能使巨噬細胞培養液TGF-β1、IL-10顯著升高，TNF-α和IL-6顯著下降，并且與用藥時間相關，這些結果說明紫草素能降低有關炎癥因子的表達，并促進與細胞增殖、分化、傷口愈合等轉化生長因子的表達，從而促進傷口愈合[21]。

4 結論

本研究結果顯示，3種不同濃度的紫草素對損傷鼻黏膜修復均具有改善作用，可能與其抑制炎癥反應，促進細胞增殖有關。