酶法測定尿液草酸和枸櫞酸的方法學性能驗證及分析前影響因素研究*

秦東芳，龔珂，王學晶，張曼（.北京大學民航臨床醫(yī)學院檢驗科，北京0023；2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院檢驗中心，北京00038；3.尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室，北京00038）

我國腎結石發(fā)病率為5.8%，尤其某些南方地區(qū)可高達10%［1］。該病復發(fā)率高，給家庭和社會都帶來巨大的經(jīng)濟負擔［2］。腎結石患者多伴有不同程度的代謝異常，如高鈣尿、高草酸尿、高尿酸尿和低枸櫞酸尿等。研究表明，伴有代謝異常的結石患者，其復發(fā)率要高于無代謝異常的患者［3］。歐洲泌尿外科學會（EAU）指南［4］和亞洲泌尿外科學會（AUA）指南［5］均建議對復發(fā)高風險的結石患者進行代謝評估，其中最主要就是24 h尿液成石危險因素分析。我國學者也推薦對于結石復發(fā)高風險人群進行血、尿代謝物的評估［6］。

草酸和枸櫞酸等小分子物質(zhì)檢測可能受到較多的干擾，尤其草酸鹽溶解度低，還受到維生素C等草酸前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［7］。近期研究表明［8］，即使是國際著名的醫(yī)院實驗室測量同一份樣本，也會因方法學和樣本前處理不同，導致草酸測量結果差異很大。因此，采用經(jīng)過驗證的樣本前處理方法以及性能良好的檢測方法，其測量結果方可準確評估患者的代謝情況，也可以在不同的研究中進行比較。

北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科團隊2017年建立了檢測尿液草酸和枸櫞酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）方法，建立了泌尿系結石代謝評估數(shù)據(jù)庫并開展長期追蹤研究［9-11］。相對于質(zhì)譜法，酶法適用范圍更廣。本研究將對酶法檢測尿液草酸和枸櫞酸的分析前因素和性能進行探討，以保證測量結果具有準確性、可比性，為將來用于結石風險分層、健康管理，以及制定相關共識指南打下良好的實驗室基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 7600全自動生化分析儀（日本日立公司）；草酸酶法檢測試劑盒及配套校準品及質(zhì)控品（批號32395，BioSystems公司）；枸櫞酸酶法檢測試劑盒及配套校準品及質(zhì)控品（批號2032019002AC，重慶博士泰公司）。

1.2 精密度和正確度驗證

1.2.1 驗證物質(zhì) 采用中國計量院草酸標準物質(zhì)BWZ8042-2016（標準值：0.199 7 mol／L，約8 990.50 mg／L）和枸櫞酸標準物質(zhì)BWZ8040-2016（標準值2.00%，約95.18 mmol／L）。用純水稀釋得到1水平，廠商提供的質(zhì)控品作為2水平，分別分裝15份，于－20℃保存，用于精密度驗證。上述標準物質(zhì)用純水經(jīng)倍比稀釋得到低、高2濃度水溶液，各分裝10份，于－20℃保存，用于正確度驗證。

1.2.2 驗證方法 參考行業(yè)標準WS／T 492—2016［12］文件方案，將精密度驗證物質(zhì)連續(xù)測定5 d，每天測定3次，分別計算2個水平的重復性及實驗室內(nèi)不精密度，評價其精密度水平；將正確度驗證物質(zhì)連續(xù)測定5 d，每天測定2次，計算均值、標準差、偏倚以及均值的95%置信區(qū)間。

1.3 線性范圍驗證

1.3.1 線性范圍驗證物質(zhì) 將標準物質(zhì)經(jīng)倍比稀釋得到的H草酸（濃度約210 mg／L）和L草酸（濃度約1.6 mg／L）、H枸櫞酸（濃度約17.85 mmol／L）和L枸櫞酸（濃度約0.19 mmol／L）分別按一定體積比配制成不同濃度梯度的樣品，進行草酸和枸櫞酸的線性范圍驗證。

1.3.2 線性范圍驗證方法 參考行業(yè)標準WS／T 408—2012［13］文件方案，將H和L按H、5H∶1L、4H∶2L、3H∶3L、2H∶4L、1H∶5L、L制成7個濃度梯度的樣本，每一濃度重復測量3次，檢查離群值和重復性，計算均值。用SPSS軟件分別擬合一次、二次和三次多項式方程，判斷線性。

1.4 干擾實驗

1.4.1 干擾物質(zhì) 用純水破壞洗滌紅細胞，制成系列濃度的血紅蛋白干擾物質(zhì)。采用北京柏定公司總蛋白標準品水溶液，稀釋后制成系列濃度總蛋白干擾物質(zhì)，用于干擾驗證。

1.4.2 干擾驗證方法 根據(jù)行業(yè)標準WS／T 416—2013《干擾實驗指南》［14］，將標準干擾物與不同濃度尿液標本以1∶19的比例混合，每一濃度重復測量3次，計算均值和偏倚。

1.5 分析前影響因素評價

1.5.1 樣本來源 選取北京大學民航臨床醫(yī)學院檢驗科當日剩余尿液標本。

1.5.2 放置時間和溫度對草酸和枸櫞酸濃度的影響 不加任何防腐劑，將尿液分別置于室溫、4℃和－20℃保存24 h。室溫和4℃保存的標本分別在0、2、4、8、24 h各測量1次，－20℃保存的標本在24 h測量1次。以室溫0 h為對照，比較24 h內(nèi)尿液草酸和枸櫞酸濃度變化情況。

1.5.3 尿液前處理方法的探討 將20例無結石對照者和20例泌尿系結石患者的隨機尿液標本，一組按100∶1和50∶1的比例即刻加入6 mol／L HCl后室溫保存24 h，另一組于室溫24 h后再分別按100∶1和50∶1的比例加入6 mol／L HCl。比較不同時間、加入不同劑量HCl對草酸和枸櫞酸測定的影響。

1.5.4 標本凍存穩(wěn)定性評價 收集24 h尿液當日剩余標本，每例分裝6份，1份于當天檢測草酸和枸櫞酸，剩余凍存于－20℃，分別于1、3、7、14、30 d時檢測草酸和枸櫞酸，檢測前按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用excel和SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的資料以ˉx±s表示，用重復測量資料的方差分析和t檢驗進行數(shù)據(jù)分析；以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 精密度和正確度驗證 由于行業(yè)標準尚未規(guī)定草酸和枸櫞酸的精密度和正確度質(zhì)量指標，故根據(jù)文獻［15］，草酸以小于1／2 24 h尿草酸基于生物學變異的不精密度范圍（10.7%）和允許偏倚（5.9%）作為本研究的性能驗證標準，枸櫞酸則以不精密度5%和偏倚5%作為質(zhì)量標準，以保證臨床可接受。

草酸和枸櫞酸試劑的精密度和正確度驗證結果見表1、2。草酸的不精密度＜10.7%，枸櫞酸的不精密度＜5%，均可滿足臨床應用。草酸和枸櫞酸2個水平的標準物質(zhì)測量結果顯示，測量均值的95%置信區(qū)間均覆蓋驗證物質(zhì)賦值。草酸的偏倚＜5.9%，枸櫞酸的偏倚＜5%，測定結果在允許范圍內(nèi)。

表1 草酸和枸櫞酸酶法試劑的精密度驗證

表2 草酸和枸櫞酸酶法試劑的正確度驗證

2.2 線性范圍驗證 草酸線性驗證最佳擬合方程為一次方程Y＝0.993X－0.216（R2＝0.999，P＜0.001），理論值與實測值的平均偏差為1.54%，在1.65～210.71 mg／L范圍內(nèi)線性良好，略優(yōu)于廠商聲明的線性范圍（1.8～180 mg／L）。

枸櫞酸線性驗證最佳擬合方程為一次方程Y＝0.953X＋0.044（R2＝0.999，P＜0.001），理論值與實測值平均偏差為4.99%，在0.19～17.85 mmol／L范圍內(nèi)線性良好，也優(yōu)于廠商聲明的線性范圍（0.2～13 mmol／L）。

2.3 干擾實驗 見表3、4。以偏倚＜10%為干擾判定標準。血紅蛋白干擾與草酸和枸櫞酸的濃度有關，高濃度下抗干擾性更強，低濃度時易受干擾。對高濃度草酸，血紅蛋白干擾的臨界值為2 g／L，但低濃度時僅為1 g／L。對于高濃度枸櫞酸，血紅蛋白干擾的臨界值為5 g／L，但低濃度時為3 g／L。總蛋白為1.5 g／L以下時對草酸和枸櫞酸均沒有干擾。

表3 血紅蛋白和總蛋白對草酸檢測的干擾

表4 血紅蛋白和總蛋白對枸櫞酸檢測的干擾

2.4 分析前影響因素評價

2.4.1 放置時間及溫度對尿液草酸和枸櫞酸濃度的影響 見表5。室溫和4℃條件下，不加任何防腐劑，放置0、2、4、8、24 h測得的草酸濃度和枸櫞酸濃度差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。2 h后草酸濃度即明顯降低。枸櫞酸在室溫和4℃放置24 h的平均變化分別為3.33%和2.67%，比較穩(wěn)定。－20℃保存24 h后，草酸濃度［（17.24±3.56）mg／L］顯著低于0 h（P＜0.05），而枸櫞酸濃度［（2.91±2.31）mmol／L］與0 h差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表5 不同條件下保存24 h對草酸和枸櫞酸濃度的影響

2.4.2 尿液前處理方法的探討 每例標本分為4組（A～D），分別按100∶1（即刻，A）、50∶1（即刻，B）、100∶1（24 h后，C）和50∶1（24 h后，D）加入6 mol／L HCl酸化。無論在無結石對照組還是結石組，草酸D組測量結果與B組差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），而A組、C組與B組相比均降低（P均＜0.05）（圖1a），枸櫞酸A、C、D組與B組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）（圖1b）。

Bland-Altman分析顯示，草酸B組和D組檢測結果有97.5%（39／40）的點在95%一致性界限范圍內(nèi)（圖1c），枸櫞酸B組和D組檢測結果有95.0%（38／40）的點在95%一致性界限范圍內(nèi)（圖1d）。因此，在尿液收集即刻和24 h后按50∶1的比例加入6 mol／L HCl兩種處理方法具有較好的一致性。

圖1 標本收集前后加入不同比例HCl對草酸和枸櫞酸濃度的影響

2.4.3 標本凍存穩(wěn)定性評價 尿液標本在－20℃條件下凍存1、3、7、14、30 d。標本解凍后，按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化，分別檢測草酸和枸櫞酸，結果見圖2和圖3。與0 d時相比，檢測結果的偏倚均在－10%～10%之間，穩(wěn)定性良好，臨床樣本不能及時檢測時可在－20℃條件保存30 d。

圖2 草酸在－20℃凍存條件下的穩(wěn)定性

圖3 枸櫞酸在－20℃凍存條件下的穩(wěn)定性

3 討論

本研究系統(tǒng)評價了兩種酶法檢測尿液草酸和枸櫞酸的試劑性能，以及分析前尿液標本的前處理對于被測量的影響。本研究草酸和枸櫞酸試劑盒分別在1.8～180 mg／L和0.2～13 mmol／L范圍內(nèi)具有良好的線性關系。與協(xié)和醫(yī)院團隊［9-10］建立的LC-MS／MS方法比較，本研究采用的酶法線性范圍更寬。初步在20例對照者和20例腎結石的人群中進行草酸和枸櫞酸的測定，草酸的范圍為7.89～41.36 mg／L，枸櫞酸的范圍為0.4～5.7 mmol／L，均在酶法的線性范圍內(nèi)，而部分枸櫞酸濃度則超出了LC-MS／MS法的線性范圍。對草酸和枸櫞酸的LC-MS／MS法和酶法檢測結果進行的比對顯示，二者準確度相當（N＝20，R值分別為0.93和0.97）［9-10］。酶法檢測草酸和枸櫞酸具有在臨床推廣使用的可靠性能。本團隊基于酶法初步對77例腎結石患者的24 h尿液代謝評估顯示，低枸櫞酸尿為最常見的代謝異常，占80.5%，33.8%存在高草酸排泄，為尋找病因和制定預防策略提供了依據(jù)。

檢測尿液草酸時，不同的實驗室采用不同的前處理方法，包括過濾、超速離心等，目的是為了去除可能干擾。我們探討了血紅蛋白和總蛋白對尿液草酸和枸櫞酸酶法檢測的干擾。研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸檢測方法相對抗干擾能力較強，而血紅蛋白對尿液草酸檢測干擾較大。血紅蛋白濃度超過2 g／L時，將顯著低估尿液草酸濃度，可能造成臨床上對草酸代謝異常的誤診。臨床上結石患者可能伴隨其他疾病，因此，應加強試劑盒抗干擾能力，或者制定合適的前處理方法，來保證被測量不受干擾。

國外指南［4-5］建議高復發(fā)風險的尿石癥患者連續(xù)收集兩次24 h尿液標本進行代謝評估，而24 h尿液收集和保存對于草酸和枸櫞酸檢測的準確性非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在不加任何防腐劑的前提下，無論室溫還是4℃保存，24 h后測得的草酸濃度均顯著降低。這可能是由于尿液中草酸鹽溶解度低，而酸性溶液不但有利于草酸鹽溶解，還可有效抑制維生素C等草酸前體物質(zhì)向草酸轉(zhuǎn)化［7］。歐洲泌尿外科指南［16］、中國泌尿外科疾病診斷指南［17］和全國臨床檢驗操作規(guī)程［18］均要求用于草酸和枸櫞酸檢測的24 h尿液標本需用HCl保存。

Braiotta等［19］認為按照100∶1的比例加入HCl，無論在24 h尿液收集前還是收集后，對于草酸濃度的檢測沒有區(qū)別。但是本研究中按100∶1的比例加入6 mol／L HCl，無論收集即刻還是24 h后酸化，均不能使尿液中草酸鹽完全溶解，導致檢測結果偏低；按照50∶1的比例加入6 mol／L HCl，無論在尿液收集即刻還是收集后24 h加入，均可保證草酸濃度穩(wěn)定，與Ferraz等［20］得出的結論一致。這可能是所用HCl的濃度不同所致。Ferraz等［20］發(fā)現(xiàn)尿液收集24 h后再按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化測得的枸櫞酸濃度輕微下降（健康對照5.9%，結石樣本3.1%），但小于實驗方法的總變異系數(shù)，不會影響臨床低枸櫞酸尿癥的診斷。

在臨床實踐中，尿石癥患者的代謝評估需要用24 h尿液檢測一系列項目，如pH、鉀、鈉和氯要直接檢測，而檢測尿酸則需堿化尿液。若24 h尿液收集前加入酸，則不能檢測尿酸等其他項目。本研究發(fā)現(xiàn)，尿液收集24 h后再酸化不影響草酸和枸櫞酸測量，更具實用性，保證患者留取一次24 h尿液可檢測多種代謝標志物。

綜上，尿液草酸和枸櫞酸的酶法檢測試劑盒的性能良好，可以滿足臨床診斷和治療監(jiān)測需求；收集尿液24 h后按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化可用于草酸和枸櫞酸的檢測。建議臨床實驗室常規(guī)開展24 h尿液草酸和枸櫞酸的檢測，輔助腎結石的臨床診療、風險評估和預防管理，以降低結石發(fā)生率和復發(fā)率。