高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白含量

◎ 鄭仕劍，徐騰洋，焦玉芬，盛華棟

（浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江 杭州 310018）

乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的球狀單體糖蛋白，屬于轉鐵蛋白家族的一員[1]。1939年Sorensen等在動物乳中發現[2]；1959年Groves用色譜制得純品；1960年Montreuij&Johansonb在人乳中發現，1961年Blanc和Isliker從人乳中分離獲得并正式命名為乳鐵蛋白[3]。乳鐵蛋白具有殺菌和抑菌[4-5]、抗病毒[6]、抗氧化、免疫調節、調整腸道菌群、促進鐵吸收等功能[7-9]，是一種新興的功能性食品營養強化劑，常用于嬰幼兒配方食品中。研究表明，人及牛的初乳中乳鐵蛋白含量較高，人乳中乳鐵蛋白含量約占總蛋白含量的22%，而牛乳中不到1%，人乳中乳鐵蛋白含量遠高于牛乳中[10]。隨著經濟的發展，人們對食品營養要求越來越高，特別是嬰幼兒食品，通過向其添加分離純化的牛初乳乳鐵蛋白，使嬰幼兒配方食品趨向于母乳化。近年來乳鐵蛋白成為了一個熱點，為了更好地研究乳鐵蛋白及其功能，需要建立有效的檢測方法。

目前，《食品安全國家標準食品營養強化劑乳鐵蛋白》（GB 1903.17—2016）中簡單介紹了食品營養強化劑-乳鐵蛋白占總蛋白含量的檢測方法[11]，《奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定液相色譜法》（T/TDSTIA 006—2019）[12]中介紹了液相色譜法測定奶與奶制品中乳鐵蛋白的含量，但國內尚未制定嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量測定的國家標準檢測方法，乳鐵蛋白未進入檢測體系，每年的食品安全監督抽檢并未包含該項檢測，嬰幼兒配方乳粉中常常添加一定量乳鐵蛋白，國外嬰兒配方乳粉中乳鐵蛋白的添加量在50 mg/100 g左右[13]，按照《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》（GB l4880—2012）規定，嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白最大允許添加量為100 mg/100 g[14]。

檢測方法的匱乏，會影響業界對嬰幼兒配方乳粉質量的判定，不利于嬰幼兒配方乳粉中營養強化添加劑的風險監督監測，因此，急需對嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白的檢測方法進行探究，完善我國食品安全管控體系。乳鐵蛋白的測定方法主要有分光光度法[15]、酶聯免疫吸附法[16-17]、毛細管電泳法[18]、高效液相色譜法[19-20]和高效液相色譜串聯質譜法[21]等。分光光度法測定乳鐵蛋白含量時的準確性較差，酶聯免疫吸附法和高效毛細管電泳法的樣品前處理操作比較煩瑣，預處理時間也較長[22]。相對而言，色譜法的測定準確性好，肝素免疫親和柱處理后目標峰明確，干擾峰少，且具有前處理簡單、用時短等優點。

嬰幼兒配方乳粉成分復雜，有脂肪、碳水化合物、蛋白質含量高，其中乳鐵蛋白含量低，各種雜蛋白干擾大，且單一儀器往往難以滿足檢測需求，多儀器聯用是乳鐵蛋白檢測方法建立的研究方向。建立嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量測定相應的檢測方法，并對不同主流品牌嬰幼兒配方乳粉進行篩查，為嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量分析提供基礎參考數據，為國家出臺相關檢測方法及添加限量要求提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

乳鐵蛋白標準品，北京美正生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國默克公司；氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，三氟乙酸（均為分析級），上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本，島津公司），配備二極管陣列檢測器（DAD）；Milli-Q超純水系統（美國，Millipore），HiTrapTMHeparin HP（1mL）肝素親和柱（美國通用電氣醫療集團）；高速離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.3 溶液的配制

（1）磷酸緩沖鹽A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉1.92 g，磷酸氫二鈉11.93 g，加適量水溶解，定容至1 L。

（2）磷酸緩沖鹽B（0.1 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉0.96 g，磷酸氫二鈉5.96 g，氯化鈉5.84 g，加適量水溶解，定容至1 L。

（3）磷酸緩沖鹽C（1.0 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉0.96 g，磷酸氫二鈉5.96 g，氯化鈉58.4 g，加適量水溶解，定容至1 L。

1.4 標準溶液的配制

1.4.1 標準儲備液的配制

乳鐵蛋白標準儲備液（10 mg·mL-1）：稱量按證書提供的純度（99%）換算后的質量0.101 0 g，用水定容至10 mL，于-20 ℃保存。

1.4.2 標準中間溶液的配制

乳鐵蛋白標準中間溶液（1.0 mg·mL-1）：準確移取乳鐵蛋白標準儲備液500μL，用磷酸緩沖鹽A定容至5 mL。

1.4.3 標準工作溶液的配制

乳鐵蛋白系列標準工作溶液：準確移取一定量乳鐵蛋白標準中間溶液，用磷酸緩沖鹽A稀釋定容，配制成0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和1.00 mg·mL-1系列標準工作液。

1.5 樣品處理方法

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入30 mL磷酸鹽緩沖液A，渦旋振蕩至全部溶解，再用磷酸調節pH至4.5，沉淀酪蛋白，混勻，10 000 r·min-1離心10 min，上清液轉移至50 mL容量瓶中，磷酸鹽緩沖液A定容至刻度，混勻，過水系濾膜，取中間濾液于2 mL進樣瓶中待HPLC檢測。

1.6 HPLC色譜條件

色譜柱：HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱；柱溫：35 ℃；進樣量：100 μL；檢測波長：280 nm；流速：0.5 mL·min-1；流動相梯度洗脫條件：0～3 min磷酸緩沖鹽A（100%），3～7 min磷酸緩沖鹽B（100%），7～22 min磷酸緩沖鹽C（100%），22～30 min磷酸緩沖鹽A（100%）。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

高效液相色譜法分離嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白常用的色譜柱有大粒徑C4、C8、C18等反相色譜柱，嬰幼兒乳粉成分復雜，且乳鐵蛋白含量低，各種雜蛋白干擾較大，以上柱子常常不能將乳鐵蛋白與其他雜蛋白進行有效分離，且需要用到肝素親和柱進行前處理凈化提純。本文提出將肝素親和柱直接作為色譜柱，凈化分離乳鐵蛋白，DAD檢測。肝素親和柱是分離糖基化蛋白質的常用凈化柱。肝素親和柱中的配體主要是硫酸化糖胺聚糖，肝素由交互的糖醛酸和D-葡糖胺單位組成，且被一個或兩個硫酸基團取代，肝素可作為親和配體，和乳鐵蛋白相互作用，具有高選擇性。因此，選擇肝素親和柱，可以使乳鐵蛋白特異性地與其結合，其他雜蛋白由于不與肝素親和柱結合，保留時間短，流出色譜柱時間較早，與乳鐵蛋白分離開。使用肝素親和柱作為色譜柱，可以減少前處理凈化過程，提高檢測效率，且液相色譜自動進樣，程序洗脫，穩定性好。標樣譜圖見圖1，樣品譜圖見表2。

圖1 乳鐵蛋白溶液（0.5 mg·mL-1）高效液相色譜圖

2.1.2 流動相條件的選擇

在pH為5～10時，肝素親和柱都是穩定的，選用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液作為緩沖溶液，在進樣前，用5～10倍柱體積的此緩沖溶液（流動相A）平衡柱子。根據乳鐵蛋白和肝素親和柱的結合特性，肝素具有大量陰離子的硫酸基團，可以增加離子強度把乳鐵蛋白從親和柱上洗脫下來。因此在流動相B中加入少量NaCl，淋洗色譜柱，梯度洗脫，逐漸增加NaCl濃度（流動相C），最終把乳鐵蛋白洗脫下來。

2.1.3 進樣體積、檢測波長及流速的確定

我國嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白最大允許添加量為100 mg/100 g，含量較低，因此為提高信號響應，選擇進樣100 μL。

使用紫外分光光度計對乳鐵蛋白標準溶液進行光譜掃描，發現其在波長220 nm、280 nm處有較強的吸收，但在波長220 nm時，基線不平穩，噪聲較大，而在280nm時，基線噪聲較小，靈敏度高，因此選擇280 nm作為檢測波長。

肝素親和柱較短，適宜流速為0.1～1.0 mL·min-1，流速太小，出峰慢，會增加分析時間，同時峰形會變寬；流速太大，目標物質還沒與干擾物質分離開就被洗脫下來。在流速0.5 mL·min-1時，峰形尖銳，干擾小，因此選擇0.5 mL·min-1的流速。

2.2 前處理條件的優化

嬰幼兒乳粉中蛋白種類繁多，成分復雜，蛋白相互之間干擾大，且酪蛋白占80%以上，為了盡可能得到較干凈的樣品，采用50%甲醇法沉淀，磷酸調pH沉淀，硫酸鋅沉淀法進行試驗，除去乳粉中以酪蛋白為主的雜質蛋白。結果表明，甲醇沉淀和硫酸鋅鹽析沉淀樣品，回收率在75%，回收率差，而用磷酸鹽提取后，磷酸調pH至4.5，離心過膜上機，能有效除去酪蛋白，回收率達95%，見圖2。

圖2 兩種前處理方法的回收率圖

該方法操作簡單，且提取液中成分與流動相中磷酸鹽緩沖液基本一致，降低提取液對流動相的干擾，故選用磷酸調pH法作為前處理凈化方法。

2.3 標準曲線及檢出限、定量限

吸取不同濃度乳鐵蛋白系列標準工作溶液100 μL，在上述色譜條件下，經HPLC測定，保留時間19.169 min，峰形尖銳，基線較平穩。

以峰面積y為縱坐標，乳鐵蛋白標準溶液質量濃度x（mg·mL-1）為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，乳鐵蛋白線性回歸方程為y=2 546 380x-640.579，相關系數0.999 98，標準曲線圖見圖3，結果顯示，在0.01～1.00 mg·mL-1，所得峰面積與濃度的線性關系較良好。

圖3 乳鐵蛋白的標準曲線圖

方法學中檢出限（LOD）和定量限（LOQ）由信噪比（S/N）計算得出，檢出限（S/N=3）為0.1 mg/100 g，定量限（S/N=10）為0.3 mg/100 g

2.4 方法的加標回收率

在空白奶粉中添加不同濃度的乳鐵蛋白，進行加標回收試驗，分別進行6平行試驗，加標回收率89.9%～101.0%，相對標準偏差1.61%～4.00%，結果見表1。

表1 不同濃度加標回收率結果表

2.5 精密度及重現性試驗

取同一市售嬰幼兒乳粉，按1.5中的方法進行樣品處理，按1.6中的色譜條件進行檢測，做6次平行試驗，結果6次測定的平均值為44.9 mg/100 g，范圍 為42.4～47.2 mg/100 g，RSD為3.85%；對 同 一市售嬰幼兒乳粉，換不同操作人員，做6次重復試驗，結果6次測定的平均值為45.1 mg/100 g，范圍為42.9～46.9 mg/100 g，RSD為3.21%，見表2。結果表明，該方法精密度較高，重現性較好。

表2 同一奶粉6次平行實驗結果和重現性測試結果表

2.6 實際樣品的檢測

對市場上不同品牌嬰幼兒乳粉進行檢測，檢測結果見表3。

表3 市場上嬰幼兒乳粉中乳糖蛋白的測定結果表

不同品牌的嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白的含量各不相同，營養成分表中顯示添加外源性乳鐵蛋白的乳粉有檢出，而營養成分表中未標注添加外源性乳鐵蛋白的乳粉都未檢出。

3 結論

本實驗采用高效液相色譜串聯肝素親和柱對嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白含量進行檢出，首次提出將肝素親和柱應用到乳鐵蛋白上機分析中，優化之后，試樣中的乳鐵蛋白經磷酸緩沖鹽A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）提取，過膜上機，經HiTrapTMHeparin HP 1 mL規格的親和柱分離，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。方法平均加標回收率在89.9%～101.0%，相對標準偏差（RSD）在1.61%～4.00%，定性檢測限（LOD）是0.1 mg/100 g，定量檢測限（LOQ）是0.3 mg/100 g。本方法與文獻中報道的方法比較，具有前處理操作簡單，快速，檢測成本低，可大批量上機檢測，重復好，靈敏度高等優勢，能滿足目前乳粉中乳鐵蛋白含量的檢測，為國家出臺相關檢測標準及添加限量要求提供技術支持。