超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法測定保健食品中的緩瀉劑

◎ 鄧 穎，林森煜，何敏恒，杜偉鋒，張瑞瑞，區碩俊

（1.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，國家加工食品質量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447；2.廣州海關技術中心，廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623）

吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁是一類臨床上使用較廣泛的緩瀉劑，可用于患者結腸鏡檢查的腸道準備[1-2]。有研究表示，吡沙可啶與鎂鹽、維生素C和西甲硅油等聯合使用，可提高患者的耐受性，得到較好的腸道準備質量[3-6]。盡管低劑量的吡沙可啶對腸道準備是安全有效的[7]，但也有研究表明，大劑量的吡沙可啶可誘發缺血性結腸炎[8]。目前，監管體系和相關的法律法規仍未完善，因此，此類緩瀉劑可能會被不良商家違法添加至保健食品中，危害消費者的健康安全。

目前，已經報道的緩瀉劑測定方法主要集中于高效液相色譜法[9-11]和高效液相色譜串聯質譜法[12-16]，近年也有報道表面增強拉曼光譜技術的測定方法[17]，高效液相色譜法在實驗室中較為常用，但多目標物的測定需要對每種物質進行基線分離，且容易受雜質峰的干擾。而表面增強拉曼光譜技術，雖然靈敏度要高于高效液相色譜法，但操作較為煩瑣，而且對于含量較低的樣品，難以檢出。高效液相色譜-串聯質譜法則可以在短時間內實現高通量的檢測，且靈敏度高，對目標物選擇性高。本文建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法對保健食品中的3種緩瀉劑進行測定。相比于一般的高效液相色譜-串聯質譜法，能測定精確分子量，減少假陽性的情況，更加高效準確地對樣品進行檢測，為相關的分析方法開發提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚?。兌却笥?7.5%，天津阿爾塔公司）；甲酸、乙腈、甲醇（HPLC級，美國Thermo Fisher公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（CNW，分析純，上海安譜公司）；C18固相萃取柱、PSA固相萃取柱和HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，CNW，分析純，上海安譜公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

AB Triple TOF5600+質譜儀（美國AB SCIEX公司）；島津LC-30AD液相色譜系統（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超 純 水 系 統（法 國Merck Millipore公司）；4k-15離心機（德國Sigma公司）；KQ-800DB超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；MS3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；Heidolph Promax 2020搖床（德國Heidolph公司）。

1.3 實驗條件

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁標準品于容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為1 000 mg·L-1的標準儲備液，于-4 ℃保存。

標準中間液：準確移取100 μL標準儲備液于10 mL容量瓶中，再用乙腈稀釋至刻度，得到10 mg·L-1的標準中間液。

標準曲線：用乙腈液稀釋標準中間液，得到各級濃度為2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1曲線。

1.3.2 前處理方法

減肥茶、片劑樣品直接粉碎，膠囊樣品取出內容物混合均勻，待測。

稱取1.0 g上述樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水，使樣品渦旋分散，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻，加入3.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，水平振搖15 min。然后置于離心機中以10 000 r·min-1離心5 min。

轉移1 mL上清液于試管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 50%甲醇水溶液，渦旋2 min，待固相萃取凈化。將C18固相萃取小柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，將待凈化的樣品加入小柱，3 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，減壓抽干小柱，最后用5 mL甲醇洗脫，洗脫液40 ℃氮吹至近干，1 mL乙腈定容，取上清液過0.22 μm有機濾膜上機。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進樣量為5.0 μL；柱溫為40 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脫模式：等度洗脫，A∶B=70∶30。

1.3.4 質譜條件

離子源：ESI和APCI復合源，正離子掃描；一級TOF-MS掃描質量范圍（m/z）：50～1 000 Da；二級IDA-MS掃描準確質量范圍（m/z）：50～1 000 Da。每10個樣品自動校正1次，正離子模式校正液流速為0.5 mL·min-1，氣簾氣（N2）：40 psi，離子源霧化氣（N2）：50 psi，離子源加熱輔助氣（N2）：50 psi，離子源溫度為550 ℃，離子源電壓5 500 V。去簇電壓DP為90 V，碰撞能量CE為（30±15）eV；監測模式：TOF-IDA-MS。

1.3.5 數據分析處理

使用AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6軟件采集化合物的母離子和碎片信息，PeakView 2.0和MasterView 2.0軟件定性處理，MultiQuant 3.0軟件定量處理。通過TOF-MS和IDA-MS過濾得到響應值超過500 cps的母離子及響應值超過5 000 cps的分子離子所產生碎片的精確分子量。以母離子的精確分子質量及其同位素豐度比、二級碎片的精確分子質量及豐度比和色譜保留時間等信息作為定性依據，以母離子響應強度進行定量。對保健食品中的3種緩瀉劑進行定性定量分析。吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的質譜參數見表1，標準品提取離子流圖見圖1。

表1 吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的碎片參數表

圖1 標準品提取離子流圖

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

實驗前期對提取劑進行了初步的篩選，分別使用乙腈和甲醇對樣品進行提取，比較了各自的回收率。結果顯示，乙腈和甲醇回收率相當，均在85%～100%。但是使用乙腈提取，可通過鹽析分層去除水溶性雜質，對儀器和色譜柱有一定的保護作用，同時也可以減少雜質在質譜中對目標物離子化的影響，降低基質效應。乙腈和甲醇的回收率見圖2。

圖2 不同溶劑對回收率的影響圖

2.2 提取方式的選擇

實驗對比了搖床、超聲和渦旋振蕩3種提取方式，在同樣提取15 min的情況下，渦旋振蕩和搖床的提取方式效率最高，回收率均在85%以上。超聲回收率只有60%～70%。其原因可能是超聲過程中，樣品和溶液的接觸部分少，溶液整體濃度不均勻所導致的，同時加入無水硫酸鎂和氯化鈉之后，由于體系中離子強度加大，導致乙腈和水之間的氫鍵斷裂，從而分層，進一步導致樣品提取不均勻，最終回收率較低。同時，考慮到日常的批量處理，最終選擇搖床作為提取方式。

2.3 固相萃取柱的選擇

由于直接提取的方式會令提取液中含有較多的雜質，影響分析結果。因此實驗采用固相萃取的凈化方式對提取液進行凈化。實驗選擇了HLB、PSA和C18固相萃取柱進行凈化，以3種目標物的回收率為評判依據，選擇回收率最高的固相萃取柱。結果顯示，HLB、PSA和C18固相萃取柱對吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的回收率差別不大，回收率最高的為C18固相萃取柱。在4 mL洗脫液的條件下，基本回收率在85%以上，穩妥起見用5 mL洗脫。詳細結果見圖3。

圖3 不同固相萃取柱對回收率的影響圖

2.4 質譜條件優化

為得到響應較高且較穩定的母離子，分別對3種緩瀉劑的ESI正負模式進行掃描測定。結果顯示，3種緩瀉劑在ESI負模式的條件下，響應遠低于正模式。因此選擇正模式進行測定，同時對不同離子加合后的母離子響應做了對比。由于3種化合物均含有N原子，因此在+H的情況下，母離子響應均較高。各離子化模式峰面積見表2。

表2 不同離子化模式下的母離子峰面積表

2.5 線性關系和檢出限

將配制好的標準系列曲線，按照1.3.3和1.3.4的儀器條件進行測定。測定后分別以濃度（μg·L-1）為橫坐標，峰面積（cps）為縱坐標進行一次方程擬合，得到3種目標物的線性方程，相關系數均大于0.998 9，說明線性關系良好。另外，進行低濃度水平的加標實驗，以3倍和10倍信噪比確定方法檢出限和定量限。其中3種目標物的檢出限為7.0～20 μg·kg-1，定量限為20～50 μg·kg-1，滿足一般樣品的含量測定要求，結果見表3。

表3 線性方程、檢出限和定量限表

2.6 回收率與精密度實驗

為驗證優化后的方法的回收率和相對標對偏差是否符合檢測的標準，對3種緩瀉劑呈陰性的減肥茶進行加標回收實驗，實驗分別對3種緩瀉劑定量限的不同倍數進行標準添加，平均回收率在84.6%～95.3%。每個水平處理6個平行樣品，并在同一日內進行測定，根據回收率結果，計算出6個平行樣品的相對標準偏差（RSD），結果在3.63%～6.22%，說明方法整體精密度較高，重復性好。具體結果見表4。

表4 不同水平的加標回收率和相對標準偏差表（n=6）

2.7 實際樣品的測定

使用建立的方法檢測了30個市售樣品，其中包括15個減肥茶和15個壓片糖果，結果為：一個壓片糖果檢出雙醋酚丁，含量為0.21 mg·kg-1。

3 結論

本文使用了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜對保健食品中的吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁3種緩瀉劑進行測定，以C18固相萃取柱對提取液進行凈化，效果較好；在優化的色譜條件下，3種緩瀉劑在3 min內完成出峰，峰型良好；結合高分辨質譜，測定目標物碎片的精確分子量，減少了假陽性的可能；通過對不同離子加合得到的母離子進行測定，選擇了響應最優的母離子；方法學驗證結果顯示，方法回收率好，重現性高，線性方程和檢出限、定量限均可滿足測定的要求。