酚酸/淀粉復合膜的制備及抑菌性能研究

◎ 徐 平，酈丹妮，余文怡，胡佩佩，覃寒珍，余作龍，魏云瀟

（浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015）

食品包裝材料與食品保存、食品安全等關系密切，如何使食品包裝材料安全、環保成為研究熱點，尤其是近年對可食性包裝膜研究較多[1-2]。可食性包裝膜分為蛋白質類、多糖類、脂類以及它們的復合成膜[3-5]，加入天然多功能活性成分取代人工合成及傳統的單功能食品添加劑已成為新亮點[6-7]。其中淀粉基可食膜是以淀粉為基質，以多元醇（如甘油、山梨醇、聚乙二醇等）及類脂物質（如脂肪酸、單甘油脂、表面活性劑等）為增塑劑，動植物膠（如褐藻膠、瓊脂等）為增強劑制作而成[8-10]。酚酸廣泛分布于自然界、種類繁多、可食用，其抗氧化、抗腫瘤、抑菌等活性功能已得到普遍認可[11-13]。本文以淀粉基可食性膜為研究對象，篩選苯甲酸型酚酸（水楊酸、龍膽酸、沒食子酸）和肉桂酸型酚酸（對香豆酸、綠原酸）（結構式如圖1所示）為抑菌劑，制備成抑菌性可食膜，對抑菌劑的抑制性和復合膜的性能進行研究。進而為酚酸類抑菌膜在功能性包裝膜的應用領域提供參考。

圖1 5種抑菌劑的結構式圖

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉（煙臺東方蛋白科技有限公司（維德力））；海藻酸鈉（山東精協海洋科技發展有限公司）；甘油（浙江杭州雙林化工試劑廠）；水楊酸、龍膽酸、沒食子酸、對香豆酸、綠原酸（上海阿拉丁試劑有限公司）；大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和酵母菌（Yeast），均由浙江樹人大學生物與環境工程學院微生物實驗室提供；肉湯培養基、Luria-Bertani培養基（LB培養基）和酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD培養基），按要求自行配制；其他化學試劑均為分析純。

1.2 試驗設備

TA.XT plus物性儀（英國Stable Micro System公司）；HZQ-X300C恒溫振蕩培養箱（上海一恒科技有限公司）；PHS-2F精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；YJ-VS-1單人垂直超凈工作臺（無錫一凈凈化設備有限公司）；GI80TR高壓蒸汽滅菌鍋（美國ZEALWAY（致微）有限公司）；KQ-500DE數控超聲波清洗（昆山市超聲儀器有限公司）；JHS-2/90恒速數顯攪拌機（杭州儀表電機有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MIC測定

采用平板打孔法[14-16]。將配制好的5種抑菌劑溶液分別加入到含有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的含菌平板中，將平板放入恒溫培養箱中培養，觀察實驗結果。大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的培養溫度為37 ℃，酵母菌培養溫度為30 ℃，培養時間為24～48 h。同時做空白對照。

1.3.2 抑菌膜的制備

參考文獻[17]方法，100 mL水溶液中添加11 g豌豆淀粉、1.2 mL甘油、0.4 g海藻酸鈉，在95 ℃下，300 r·min-1攪拌30 min，待淀粉糊化后，按照抑菌劑的MIC加入10倍～20倍量酚酸（按淀粉質量比計）考察抑菌性；加入10%抑菌劑（按淀粉質量比計）考察不同抑菌膜的力學性能。攪拌10 min，經真空脫氣后，流延鋪膜于鋼板上，并在50 ℃烘干，揭膜，儲存待用。

1.3.3 膜的抑菌性

分別配制蛋白胨培養基、LB培養基、YPD培養基等3種固體培養基，等待平板冷卻后用移液槍分別移取100 μL各菌懸液于對應的培養基上，涂布均勻。將淀粉膜和不同濃度的酚酸/淀粉抑菌膜打成3 mm小圓片，分別將膜片放置于涂有菌液的平板上。倒置培養24～48 h，通過觀察平板上抑菌圈的大小，衡量膜的抑菌性[18]。

1.3.4 膜的力學性能

選擇平整、均勻、無孔洞、無皺褶的膜，用螺旋測微器（精度0.01 mm）測樣品的4個頂點和中心點上的厚度，取5個值的平均值，即為膜的厚度，單位為mm[19]。參照GB/T 1040.3—2006[20]，將樣品裁成長10 cm，寬0.5 cm的長條，用物性儀測定膜的拉伸強度（TS）和斷裂延伸率（E），每組各測3個垂直與水平樣品，共6個平行樣品，并根據式（1）、式（2）計算平均TS與E。標距為50 mm，試樣速度為100 mm·min-1。

式中：TS-抗拉強度（MPa）；F-膜所受拉力（N）；S-膜的橫截面積（m2）。

式中：E-斷裂延伸率（%）；L0-試樣原始標準距離（mm）；L-試樣斷裂時標準距離（mm）。

1.3.5 紅外光譜分析

裁剪一小片制得的可食膜樣品，在Tensor 27型紅外光譜儀進行紅外光譜掃描，檢測膜組分對膜結構的影響。

2 結果與分析

2.1 MIC分析

5種抑菌劑的MIC表現出不同的抑菌特性，結果如圖2、表1所示，其中水楊酸的抑菌能力最好，而龍膽酸的抑菌性較差，甚至對酵母菌沒有抑制性。水楊酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的MIC分別為9.375 mg·mL-1、15.625 mg·mL-1和9.375 mg·mL-1，而抑制性最差的龍膽酸分別為143.75 mg·mL-1、193.75 mg·mL-1和沒有抑制性。

表1 5種抑菌劑的MIC表（單位：mg·mL-1）

圖2 5種抑菌劑的MIC圖

SáNCHEZ-MALDONADO等[21]從構效關系的角度研究12種酚酸的抗菌活性，發現相同取代基的肉桂酸型酚酸抗菌能力優于苯甲酸型酚酸，且羥基數目越多，苯甲酸型酚酸抗菌效力越弱，而對肉桂酸型酚酸影響不大；氧甲基團取代后，苯甲酸型酚酸抗菌作用增強，而肉桂酸型酚酸的抑菌能力無顯著性變化；親油性對苯甲酸型酚酸抗菌活性的影響大于對肉桂酸型酚酸。本實驗中相同羥基的水楊酸抑菌性大于對香豆酸，而含兩個羥基龍膽酸抑菌性低于含3個羥基的沒食子酸。因此酚酸的兩親性和所在的培養體系對抑菌劑的抑菌效果影響不可忽視[22-23]。

由于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌分別代表革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌，因其細胞壁的厚薄程度、結構復雜性和與細胞膜的關系導致同一種抑菌劑的MIC不一，同時，不同抑菌劑的MIC沒有一致性。

2.2 膜的抑菌性分析

不同抑菌膜的抑菌性如圖3和表2所示，當抑菌劑加入到淀粉膜中，其抑菌性降低明顯，如水楊酸和對香豆酸；或沒有抑菌性，如沒食子酸、綠原酸和龍膽酸。水楊酸/淀粉膜對酵母菌的抑制性較為明顯，MIC由水楊酸的MIC 9.375 mg·mL-1增加到水楊酸抑菌膜的MIC 117.125 mg·g-1；而對香豆酸加入淀粉膜中的MIC增幅最小。主要原因是制膜為水溶液，對濃度較高、油溶性的抑菌劑在膜液中分散影響較大，同時成膜后固體膜影響抑菌劑在培養基上擴散效果。過高濃度的沒食子酸、綠原酸和龍膽酸無法成膜，所以其膜的抑菌性實驗無法開展。

表2 不同抑菌膜的MIC表（單位：mg·g-1）

圖3 不同抑菌膜的MIC圖

2.3 膜的力學性能分析

不同抑菌劑對淀粉膜的力學性能如圖4所示，抑菌劑降低了淀粉膜的拉伸強度，而對淀粉膜的斷裂延伸率影響不一。從圖3中不同膜的圖片可知，膜的均一性和表面光滑程度隨著抑菌劑的比例和種類而變化，其中對香豆酸/淀粉膜內出現肉眼可見的細小顆粒，進而表明對香豆酸對淀粉膜的拉伸強度改變最大，由15.33 MPa降低到4.28 MPa，由于小分子的抑菌劑加入起到增塑作用，降低了膜的強度；而相對淀粉膜的斷裂延伸率為62.67%，抑菌劑綠原酸具有與淀粉單元相似的結構和柔性成分，使膜的斷裂延伸率略微提高到67.45%。

圖4 淀粉膜和不同抑菌膜的力學性能圖

2.4 紅外光譜分析

對抑菌劑和其抑菌膜的FTIR分析如圖5和圖6所示。在3 400～3 200 cm-1波長處的吸收峰均是各物質分子內或分子間的O-H伸縮振動峰；過強的羥基峰導致無法觀察到C-H伸縮振動峰。在1 750～1 650 cm-1波長處為各物質的C=O伸縮振動峰；在1 520 cm-1、1 450 cm-1、1 380 cm-1和780 cm-1波長處為芳香環骨架的振動吸收峰；在約12 00 cm-1波長處為O-H的彎曲振動吸收峰[24-25]。當抑菌劑加入淀粉膜后，O-H伸縮振動峰更加強烈，C=O伸縮振動峰有所減弱，但發生了紅移，說明有新的氫鍵生成，同時也可能導致抑菌效果的變化。

圖5 5種抑菌劑的FTIR圖

圖6 淀粉膜和不同抑菌膜的FTIR圖

3 結論

本文通過對兩個種類的5種酚酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的MIC、加入到淀粉膜中對3種菌的MIC以膜性能進行考察。結果表明，結構相似的5種酚酸對3種菌的抑制性差異較大，其中水楊酸的抑菌性最佳，龍膽酸的抑菌性最差，甚至對酵母菌沒有抑制性；當加入到淀粉膜中抑菌性均有不同程度的下降，其中，沒食子酸、綠原酸和龍膽酸表現出沒有抑菌性；抑菌劑的加入對淀粉膜的斷裂延伸率影響不大，而對膜的拉伸強度影響較大，通過FTIR分析，分子間的作用力起到一定作用。