柱前衍生-高效液相色譜法比較使君子果實與種仁炮制前后使君子氨酸的含量*

廖佳慧，楚洪軍，謝 瑞，許詩怡，游元元,2

（1.成都醫學院藥學院，四川 成都 610500；2.四川省高校結構特異性小分子藥物研究重點實驗室，四川 成都 610500）

使君子為使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的干燥成熟果實，具有殺蟲、健脾、止瀉等功效，李時珍評價其為“小兒諸病要藥”[1-2]。2020年版《中華人民共和國藥典》（下簡稱《中國藥典》）使君子項下有果實與種仁兩個藥用部位，有生用與炒用兩種用法[3]。呂文海等[4]研究發現使君子的果實與種仁化學成分差異較大，而加熱前后也有明顯的含量及效用區別，提示使君子以不同部位及制法入藥時其化學組分并不一致，進而影響臨床療效。現行《中國藥典》僅以胡蘆巴堿作為使君子的唯一含量測定指標，且無論果實或種仁、生品或炮制品皆為同一含量限度要求，但胡蘆巴堿本身的生理活性與使君子的功效并不吻合[5]，故現行使君子質量評價標準值得商榷。

使君子中含有的使君子氨酸（quisqualic acid，QA）有明確的驅殺蛔蟲、蟯蟲、絳蟲等腸道寄生蟲的作用[6-8]，與藥材的驅蟲功效相符，可將QA作為質量標志物對藥材進行品質評價。QA為非蛋白氨基酸，基本無紫外吸收，難以直接用HPLC-UV法進行檢測，但被衍生化后則生成紫外吸收較強的衍生物，故可采用柱前衍生-高效液相色譜（Pre-column derivatization HPLC）法對QA進行分析[9-10]。本研究以2,4-二硝基氯苯為衍生劑，建立了使君子中QA的柱前衍生-高效液相色譜含量測定方法，并對15批市售使君子不同入藥部位及炮制前后的QA含量進行測定和比較，以期為完善該藥材的質量評價標準奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20at高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Lcsolution色譜工作站（日本島津公司）；XPE26電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK250H超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；HH-4水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；GL-16冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）。

1.2 試藥 使君子氨酸（南京沛微生物科技有限公司，批號：TRCW150707，純度＞97%）；15批使君子藥材分別購自于成都荷花池中藥材市場、飲片公司及網絡渠道，經成都醫學院中藥學教研室游元元教授鑒定為使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的成熟果實，樣品信息見表1。甲醇為色譜純，水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 使君子不同樣品的制備 取15批市售使君子，每批部分去除果殼后得種仁。分別取果實與種仁適量，按2020年版《中國藥典》四部“炮制通則”中清炒法與面煨法處理。得到15批藥材兩個藥用部位（果實與種仁）各3種制品（生品、清炒品、煨制品），分別粉碎、過篩，備用。

2.2 色譜條件 采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.2%磷酸鹽水溶液（A）-甲醇（B），以1 mL/min的流速進行梯度洗脫（0～8 min，5%B→15%B；8～15 min，15%B→20%B；15～22 min，20%B→30%B；22～30 min，30%B→38%B；30～35 min，38%B→38%B），檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.3 對照品溶液的制備 取使君子氨酸對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.42 mg的對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液1 mL置試管中，加入0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL，再加入0.01 mol/L硼砂緩沖液適量，搖勻，于80 ℃水浴條件下加熱30 min，冷卻至室溫，轉移至10 mL量瓶中，用硼砂緩沖液稀釋至刻度，4 ℃9 000/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 取使君子樣品粉末約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚10 mL，浸泡15 min，濾去溶劑，于脫脂后的粉末中精密加入水10 mL，室溫浸提30 min，離心10min，濾過，精密量取續濾液1mL置試管中，加入0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL，再加入0.01 mol/L硼砂緩沖液適量，于80 ℃水浴條件下加熱30 min，冷卻至室溫，轉移至10 mL量瓶中，用硼砂緩沖液稀釋至刻度，4 ℃9 000/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.5 陰性對照品溶液的制備 按本品處方比例，制備不含使君子氨酸的陰性對照品。

2.6 系統適用性試驗 取對照品、供試品及陰性對照樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，結果見圖1。使君子氨酸衍生物與相鄰色譜峰分離良好，理論塔板數不低于20 000。

圖1 各成分HPLC 圖譜

2.7 線性關系考察 精密吸取“2.3”項下對照品儲備溶液適量，按“2.3”項下方法自“置試管中，加0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL”步驟起操作，依次配置8個不同濃度的系列濃度溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，測定峰面積。分別以QA對照品峰面積Y為縱坐標，QA對照品濃度X為橫坐標，繪制工作曲線，計算回歸方程。結果顯示QA在3.2～420.0 μg/mL范圍內呈良好線性關系，回歸方程為Y=1 367.4X-4 494.3（r=0.999 7）。

2.8 檢測限和定量限的考察 取“2.3”項下對照品儲備溶液適量，加水逐級稀釋后按“2.3”項下方法從“置試管中，加0.05 mol/L 2，4-二硝基氯苯溶液3 mL”步驟起操作，按“2.2”項下色譜條件進樣并記錄色譜圖。經計算QA的檢測限（S/N=3）為1 μg，定量限（S/N=10）為3 μg。

2.9 精密度試驗 精密吸取“2.3”項下對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積并計算其RSD。QA峰面積的RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.10 穩定性試驗 取同一份使君子種仁生品供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進樣測定，測定峰面積并計算RSD。QA峰面積的RSD為1.78%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.11 重復性試驗 取同一批使君子種仁生品粉末5份，每份約0.25 g，精密稱定，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按回歸方程計算QA含量及RSD。QA的平均含量為1.43 mg/g，RSD為1.18%，表明該方法的重復性良好。

2.12 加樣回收試驗 取同一批使君子種仁生品粉末9份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分為低、中、高3組，分別加入5.26 mg/mL的QA對照品溶液150、300、400 μL，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按色譜條件進樣測定并計算回收率。QA的平均回收率為101.95%，RSD為2.21%，表明該方法的加樣回收率良好，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=9）

2.13 樣品測定 取15批使君子果實與種仁的生品、清炒品及煨制品，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，按回歸方程計算QA含量，結果見表3、圖2～4。表明果實中QA含量均低于相同處理方式的種仁中QA含量，QA含量的趨勢為生品＞清炒品＞煨制品。

表3 使君子不同樣品中QA 含量測定結果

圖2 生用果實與種仁QA 含量比較

圖3 果實炮制前后QA 含量比較

圖4 種仁炮制前后QA 含量比較

3 討 論

中藥質量標志物是指存在于中藥材和中藥產品中固有的或加工制備過程中形成的，與中藥的功能屬性密切相關且能夠反映中藥安全性和有效性的標示性化學物質[11]。文獻報道QA為使君子驅蟲的主要有效成分，可以在一定程度上表征藥材的品質，符合質量標志物的要求。

本實驗采用了柱前衍生-高效液相色譜法對QA進行含量測定。在同樣采用此法進行QA含量測定的文獻報道中[12]，使君子樣品需回流法脫脂3次后再用水處理3 h，繁瑣而費時，而本實驗方法的樣品前處理更簡單方便。衍生過程中，文獻方法需使用6種試劑進行衍生，按文獻提示操作重復實驗后發現衍生并不完全，而本法的衍生過程只需3種試劑，衍生效果較理想。文獻方法的色譜條件中水相的pH值為9.2，不利于色譜柱的使用和保存，本法的水相pH值為7.6，適用于大多數C18柱。

15批市售使君子藥材果實中的QA含量均低于種仁。《藥性粗評》記載[13]：使君子以果實及種仁入藥的情況均存在，但以種仁入藥最為多見。本實驗結果佐證了使君子種仁入藥為主的合理性。無論果實或種仁，加熱炮制后QA含量均有下降，且加熱程度越劇烈，QA的下降程度越大。推測原因為藥材中還存在其他種類的氨基酸，與QA共存時遇熱會發生聚合反應[14]；藥材中的葡萄糖、果糖等還原糖還可能在加熱條件下與QA發生美拉德反應[15]。故以驅蟲為主要治療目標時，使君子藥材的炮制加熱程度應注意掌握。

15批使君子樣品中的QA含量有較明顯差異，以生品果實為例，不同批次間QA含量可相差近5倍。推測是儲存時間、儲存條件的差異影響了藥材的品質。

本研究將與使君子功效密切相關的化合物QA作為質量標志物，建立了測定其含量的柱前衍生-高效液相色譜法。該方法操作簡便，衍生化完全，方法學考察結果良好，為完善使君子質量評價標準提供了參考。實驗結果顯示種仁中的QA含量高于果實，而經加熱炮制后QA含量有所下降，這為使君子入藥部位及制法的合理選擇提供了依據。