不同炮制方法對紫蘇子中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量變化的影響*

史勤怡，張倩玉，劉 莉，曾 超，劉金花

（1.徐州市兒童醫院，江蘇 徐州 221002；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023）

紫蘇子為紫蘇Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果實，在臨床使用上多用于紫蘇子的炮制品[1-2]。在臨床上，生紫蘇子用于腸燥便秘，而炒紫蘇子緩和辛散，多用于人的咳喘[3-4]。紫蘇子炒制前后藥性和藥理作用均有不同程度的變化，說明炒制前后其成分含量和種類有可能發生了改變。咖啡酸屬于苯乙烯酸類化合物，在多種植物中存在，主要的藥理作用包括調節免疫、保護心血管和降血糖等作用[5]；迷迭香酸具有抗炎、免疫抑制等藥理作用[6-9]；木犀草素為黃酮類化合物，主要的藥理作用有抗炎、抗菌、抗過敏等[10-11]；芹菜素也為黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤和機體免疫調節等藥理作用[12-15]。目前，對紫蘇子不同炮制品活性成分含量變化的研究未見報道。筆者以紫蘇子不同炮制品中的4種活性成分（咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素）為測定的目標成分，采用HPLC法測定紫蘇子不同炮制品化學成分含量的變化，為進一步對紫蘇子不同炮制品的質量變化和藥效物質基礎提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260-П高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，十萬分之一]；超聲清洗器（KQ3200DE型，昆山市超聲儀有限公司）；分析天平[Practum224-1CN型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；高速臺式離心機（TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26型，上海齊欣科學儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9203A型，上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 藥材及試劑 紫蘇子藥材采摘于廣西桂林市龍勝縣，經廣西中醫藥大學第一附屬醫院主任中藥師曾超鑒定，紫蘇子為紫蘇Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果實。紫蘇子不同炮制品，在實驗室自行炮制；因實驗研究需要，紫蘇子的炮制方法分為陰干炮制、烘干炮制（60℃）、烘干炮制（80℃）、清炒炮制和微波炮制（12 min），按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）進行相關檢查，結果均符合規定。乙腈（Merck色譜純），甲醇（分析純，天津市進豐化工有限公司），水為超純水。對照品信息見表1。

表1 對照品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo ODS-2 Hypersil（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，洗脫程序為梯度洗脫（見表2），咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的檢測波長分別為320、330、350和340 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，色譜柱的理論塔板數按迷迭香酸峰計算應不低于3 000。4個成分都能達到較好分離，分離度R＞1.5，樣品中其它成分對測定成分無干擾。按照上述條件各組分分離度良好。（見圖1）

圖1 紫蘇子HPLC 圖

表2 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素對照品各適量，加70%甲醇使溶解，配制成每1 mL分別含咖啡酸82.75 μg、迷迭香酸1 925.28 μg、木犀草素152.24 μg、芹菜素112.68 μg的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定中藥紫蘇子藥材樣品粗粉約1.0 g，放至具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL后，稱其重量，然后水浴回流提取藥材1 h后取出，放至室溫，再次稱重，如果重量減少就使用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下配制好的混合對照品溶液0.3、1.0、3.0、5.0、9.0 mL，至10 mL棕色容量瓶中，然后加入70%甲醇溶液至刻度，輕輕搖勻，即配得一系列混合對照品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件，分別注入一系列的混合對照品溶液進高效液相色譜儀中，測定并記錄對應成分的峰面積。以各成分的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，各成分的峰面積（Y）為縱坐標，繪制各成分的線性方程，即得線性回歸方程和對應的相關系數（見表3）。結果表明，咖啡酸、迷迭香酸、木樨草素和芹菜素在對應成分濃度范圍之內成良好的線性關系。

表3 紫蘇子中各成分的線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗 按照“2.1”項下的色譜條件，精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，連續進樣6次，然后分別記錄各活性成分對應的峰面積，并計算混合對照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值。由測得的峰面積計算混合對照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值，即RSD值分別為0.62%、0.35%、0.94%、0.72%，均小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.3.3 穩定性試驗 取陰干炮制品紫蘇子粗粉1.0 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，然后分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”項下色譜條件分別依法測定對應成分并記錄對應成分的峰面積。結果計算得紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值，即RSD值分別為2.08%、0.97%、1.62%、1.86%，均小于3.0%，說明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取中藥紫蘇子不同炮制品藥材粗粉1.0 g，每種紫蘇子炮制品稱取6份，按照“2.2”項下的供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定各供試品的峰面積，計算紫蘇子不同炮制品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量。結果測得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.149 6、3.019 0、0.237 3、0.153 6 mg/g；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.136 5、2.915 2、0.231 9、0.155 8 mg/g；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.135 9、2.811 2、0.231 5、0.156 8 mg/g；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.115 7、2.751 9、0.241 0、0.169 6 mg/g；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均藥材含量分別為0.140 9、2.988 5、0.234 9、0.161 7 mg/g。

結果計算得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.42%、0.91%、1.57%、0.85%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為0.98%、0.75%、1.08%、0.96%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.51%、1.02%、1.45%、0.90%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.14%、1.52%、1.08%、1.39%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素藥材含量的RSD分別為1.82%、1.37%、0.98%、1.25%。其RSD值均小于3.0%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次不同炮制品紫蘇子藥材粗粉，即陰干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品、微波炮制品（12 min），藥材粗粉各6份每份0.5 g，加入適量的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素對照品，按照“2.2.2”項下的方法制備成供試品溶液，按照“2.1”項下條件測定，根據線性方程，分別計算陰干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品和微波炮制品（12 min）紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均回收率和對應的RSD值。

結果計算得陰干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為100.31%、97.95%、101.02%、98.96%，其RSD分別為1.69%、2.45%、1.72%、2.88%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為99.40%、98.83%、100.14%、97.98%，其RSD分別為1.78%、2.07%、2.40%、1.56%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為98.62%、99.65%、98.81%、99.84%，其RSD分別為1.25%、2.32%、1.58%、1.91%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為98.72%、101.27%、99.35%、98.62%，其RSD分別為2.19%、1.87%、2.82%、1.75%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加樣回收率分別為99.83%、98.61%、102.06%、97.98%，其RSD分別為2.73%、1.80%、1.92%、2.26%。其RSD值均小于3.0%，實驗結果表明該方法準確性良好。

2.4 樣品含量測定 分別稱取紫蘇子不同炮制品藥材粗粉各3份，每份1.0 g，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件測定紫蘇子的4種活性成分，并采用線性方程計算紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量（mg/g），結果見表4。

表4 不同炮制品紫蘇子平均含量測定結果（n＝3）

3 討 論

3.1 流動相的選擇 本實驗采用HPLC法測定紫蘇子不同炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分含量，考察了洗脫程序所使用的流動相，實驗考察中發現流動相中加入不同種類的有機酸對4種活性成分的峰型和分離度有一定的影響。本試驗采用甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%冰醋酸等流動相進行試驗考察，結果說明乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫，紫蘇子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的峰型和分離效果較好，目標成分與雜峰達到基線分離。因此可以推測本實驗方法快速穩定、簡便、重復性好等，可用于中藥紫蘇子藥材的提取、工藝優化及其藥材質量標準等相關研究。

3.2 波長的選擇 中藥方劑成分復雜，本實驗采用HPLC法測定5種不同炮制品的紫蘇子中的4種活性成分的含量，通過前期預試驗，試驗考察了流動相、柱溫、流速等外部因素，從實驗結果中選擇峰型較好，基線較平穩，分離度較好的實驗色譜條件。對于本試驗目標成分波長的選擇，是考慮到中藥紫蘇子中4個活性成分的最佳紫外吸收，使被測的活性成分都有較好的紫外吸收，通過試驗比較后發現，中藥紫蘇子中的活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分別在320 nm、330 nm、350 nm和340 nm波長下有較好的紫外吸收，因此試驗選擇波長切換法測定不同炮制品紫蘇子中4種活性成分的含量，此試驗方法操作簡單、測定速度快、儀器靈敏度高，對中藥紫蘇子藥材的質量控制有一定的參考價值，對于其它中藥材的質量分析控制也有一定的指導作用。

3.3 柱溫、流速的選擇 本實驗通過考察4種不同柱溫20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃對分離度、出峰時間及基線的影響，經過分析色譜峰可知，柱溫影響較小，因此本試驗柱溫采用30 ℃；同時研究者還考察3種不同的流速0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min對分離度和基線的影響，色譜圖直觀顯示當流速為1.0 mL/min時，其分離度較好，基線也較平衡，故本試驗采用的流速為1.0 mL/min。

3.4 結果分析 根據含量測定結果可知，5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素的含量分別為0.116 0～0.150 6 mg/g、2.752 6～3.032 5 mg/g、0.221 9～0.240 5 mg/g、0.153 2～0.170 2mg/g，其中陰干炮制品樣品中咖啡酸、迷迭香酸含量最高，分別為0.150 6 mg/g、3.032 5 mg/g，清炒炮制品樣品中木犀草素、芹菜素含量最高，分別為0.2405mg/g、0.170 2 mg/g。5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中4種成分的含量具有一定的差異，這可能與藥材的炮制方法或者干燥方法有關，有待進一步研究。綜上，本研究建立的5種不同干燥及炮制方法制備的紫蘇子樣品中4個成分的含量測定方法穩定可靠，可為其質量控制提供參考，也為其中藥藥效物質基礎研究提供借鑒。

3.5 小結 本實驗建立了高效液相色譜法測定紫蘇子不同炮制品中的4種活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量的方法，可用于比較不同炮制品有效成分的含量差異，該方法為闡明紫蘇子不同炮制品的藥理作用機制的研究提供科學依據，為提高中藥材質量標準提供指導，可作為紫蘇子及其不同炮制品的質量控制方法，以及擴大到其它中藥材及其炮制品的質量標準。