電針人迎、太沖穴對自發性高血壓大鼠模型腎臟組織FoxP3和RORγt的影響*

張麗麗 ，杜凱 ，王洋 ，王文慧 ，趙孟雄 ，沈燕 ，4

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；3.天津市針灸學重點實驗室，天津 300193；4.天津市針灸研究所，天津 300193）

高血壓已成為全球重大公共衛生問題，是引起心腦血管、腎臟疾病的重要危險因素[1]，研究表明，高血壓前期的發生率約占成人50%，遠期并發癥使患者壽命減少5年[2]。高血壓病前期是高血壓和正常血壓之間的一種臨界狀態，其危害主要表現在極易進展為臨床高血壓，此期已存在靶器官損害，如微量白蛋白尿、視網膜小動脈狹窄、頸動脈內中膜厚度增加，左室肥厚等[3]。因此，深入研究高血壓病的發病機制，積極探索有效的干預方法，是當前高血壓防治的重點和難點。針灸干預疏通經絡，平衡人體氣血陰陽。因此，在高血壓病早期或尚未發生靶器官損害及并發癥發生的情況下，采用針灸治療以調和經絡氣血，使機體達到陰平陽秘的狀態，是有效防治高血壓病的重要手段。

近年來，越來越多的研究發現免疫-炎癥機制對高血壓病的發生、發展起重要的作用[4]，Th17細胞和Treg細胞在高血壓病中的關系日益受到重視，腎組織免疫炎性細胞的浸潤與高血壓病發生密切相關[4]。高血壓病前期大鼠Treg細胞比例降低，Treg細胞下降促進高血壓病的發生發展[5]。正常情況下兩種細胞效應處于一種平衡狀態，兩者失衡是促進高血壓病發生發展的重要因素。叉頭狀轉錄因子（FoxP3）、維甲酸相關孤獨核受體-γt（RORγt）分別為Treg細胞和Th17細胞特異性轉錄因子。干預FoxP3、RORγt這一重要環節可能起到緩解疾病進展的作用。為此，本研究采用“活血散風”針刺法干預4周齡自發性高血壓大鼠模型，從FoxP3、RORγt蛋白及mRNA的調節作用角度，觀察電針對自發性高血壓大鼠（SHRs）的治療效果，為電針干預高血壓前期大鼠效應機制的闡明提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SHR大鼠16只，4周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，適應性喂養2 d。SHR大鼠經篩選后分為即模型對照組（SHR組）、電針+SHR組，每組8只；健康雄性WKY 8只，4周齡，作為正常對照組（WKY組）。實驗動物于二級動物房飼養，室溫20～25℃，光照時間07：00～19：00，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑和儀器 ROR兔多抗（Abcam公司，ab278099），FoxP3 兔多抗（Abcam 公司，ab215206），β-actin鼠單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，TA-09），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB2301）。電針儀（HANS-200E，南京濟生醫療科技有限公司），血壓儀（北京軟隆生物技術有限公司，中國），LightCycler?96實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（羅氏公司，瑞士）。

1.3 治療方法

1.3.1 穴位及針具的選擇 大鼠人迎穴定位參照沈雪勇《經絡腧穴學》和王增濤《Wistar大鼠解剖圖譜》，位于頸部三角區內、平耳垂，當胸骨舌骨肌與胸鎖乳突及上緣交點、頸動脈搏動處。太沖穴位于后肢足背1、2趾骨間凹陷處。

針具選用“華佗牌”毫針（蘇州醫療用品廠生產）。電針儀選用韓氏神經穴位刺激儀HANS-200E（南京濟生醫療科技有限公司，產品標準編YZB/蘇0049-2008）。

1.3.2 干預方法及電針刺激參數 1）電針+SHR組：采用鼠衣束縛固定大鼠，暴露針刺部位，針刺雙側人迎穴，針刺深度5 mm，雙側太沖穴，針刺深度2 mm；刺激參數：疏密波，頻率2/15 Hz，電流1 mA，持續時間15 min。每日上午10點針刺1次，5日/周，共2周。2）SHR組和WKY組：均不給予任何干預，僅于每日針刺干預同一時間點給予相同方法及強度的束縛固定。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 血壓測量 使用日本Softron無創血壓儀進行鼠尾血壓測量。在室溫（22±2）℃條件下，測量大鼠安靜、清醒狀態鼠尾血壓，待血流波形穩定后，開始記錄數據，共記錄5組，去掉最高值和最低值，取平均值。測量干預前、干預1周后、干預2周后大鼠的血壓。

1.4.2 腎臟組織形態 在治療結束后2周時，各組大鼠禁食24 h，按3.5 mL/kg的比例腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后頸椎離斷處死，固定在大鼠手術臺上，常規消毒，沿腹正中線剪開腹腔，迅速取出大鼠腎臟，剝離包膜，左腎稱量質量后放入固定瓶內（4%多聚甲醛固定液）備用，右腎立即放入液氮凍存，置于-80℃冰箱內保存備用。

將制備好的部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛固定液24h以上，梯度乙醇及二甲苯脫水，石蠟浸蠟，包埋，切片機上切片，片厚4μm；二甲苯脫蠟20mim，梯度乙醇各5 min，流水沖洗15 min，蘇木精染色8 min，清水沖洗10 min，伊紅染液染色1～3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察腎臟組織形態。

1.4.3 FoxP3、RORγt表達水平檢測

1.4.3.1 蛋白免疫印跡（Western blot）法測定腎臟FoxP3、RORγt蛋白的表達 取腎臟100 mg，剪碎，加入裂解液，充分研磨，冰上裂解30 min，7800 g，離心20 min取上清液，BCA法計算樣本蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴中10 min使蛋白變性，制備分離膠和濃縮膠，用微量加樣器將樣品加入樣品槽中，上樣量為 30 μg，電泳：濃縮膠 80 V 30 min，分離膠12 V 50 min；濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜上，電流為300 mA 2 h，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜 3×5min，稀釋一抗：β-actin1∶1000，RORγt1∶500，FoxP3 1∶1 000；將膜放入雜交袋中加入一抗，4℃孵育過夜；室溫平衡 30 min，TBST 洗膜 3×5 min，稀釋二抗：辣根酶標記的山羊抗兔1∶20 000，辣根酶標記的山羊抗小鼠1∶20 000，將膜浸在二抗中，于搖床上室溫孵育1 h。洗膜后進行ECL反應，凝膠成像分析系統攝像分析。用Image J軟件讀取灰度值對蛋白進行半定量分析。

1.4.3.2 RT-PCR技術測定腎臟組織FoxP3、RORγt mRNA表達 取100 mg腎臟組織，加入液氮研碎組織，收集組織粉于EP管；加入1 mL Trizol裂解液輕輕震蕩，使組織充分裂解，冰上靜置5 min；12 000 g，4℃離心5 min，吸取上清液，移入新的EP管中。每管加入200 μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5 min，12 000 g，4℃離心15 min；吸取上層水相移至新的EP管中，每管加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，12 000 g，4℃離心10 min，棄上清液；加入1 mL 75%的乙醇，渦旋混合，7 500 g，4℃離心5 min，棄上清液，室溫干燥 10 min；加入 20 μL 的DEPC水溶解RNA（或置于-80℃冰箱保存備用）；取少量總RNA用微量核酸蛋白分析儀分析RNA含量和純度；將提取的RNA反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR擴增反應。反應體系為：MIX 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 cDNA 2 μL，水 7 μL；反應參數為：預變性 95 ℃，3 min；變性95 ℃，5 s；退火 56 ℃，10 s；延伸 72 ℃，25 s；39 個循環；溶解曲線分析；引物序列如下：RORγt-F：ATGGAGCTCTGCCAGAATGA，RORγt-R：TGCGGTTGTC-AGCATTGTAG；FoxP3-F：CAGCGTGGTTTTTCTTCTCGGTATA，FoxP3-R：TGGTGAAGTGGACTGACAGAAAAG；GAPDH-F：TGAGTCCTTCCACGATACCA；GAPDH-R：ATCCCATCACCATCTTCCAG。

1.5 統計學方法 數據應用統計軟件SPSS 22.0進行統計分析，統計描述采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），各個實驗組之間的兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD test），P＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血壓水平變化 干預前3組大鼠收縮壓比較，SHR組、電針+SHR組大鼠收縮壓水平顯著高于 WKY 組（P＜0.05），提示 4周齡 SHR 大鼠血壓明顯高于WKY大鼠；干預2周后，與SHR組比較，電針+SHR組收縮壓水平降低，具有統計學差異（P＜0.05），提示電針有延緩收縮壓上升的趨勢。見表1。

表1 各組大鼠干預前后收縮壓變化情況（±s）Tab.1 The level of blood pressure in the WKY，SHR and acupuncture+SHR groups（±s）mm Hg

表1 各組大鼠干預前后收縮壓變化情況（±s）Tab.1 The level of blood pressure in the WKY，SHR and acupuncture+SHR groups（±s）mm Hg

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 干預前 干預后1周 干預后2周WKY 組 8 132.50±7.75 142.13±4.67 145.13±12.81 SHR 組 8 145.75±12.54*155.38±13.90*177.38±6.16*電針+SHR 組 8 145.25±5.65*154.13±9.70*168.25±3.62*#

2.2 大鼠腎臟形態 WKY組腎臟組織可見腎小管排列緊密，腎小管上皮細胞形態正常，腎小球毛細血管界限較清晰；SHR組、電針+SHR組腎臟組織腎小球形態尚正常，少量的腎小管上皮細胞胞質疏松，少量腎小管上皮細胞脫落入管腔（箭頭示）。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色Fig.1 HE staining of rat kidney in the WKY，SHR and Acupuncture+SHR groups

2.3 大鼠腎臟組織FoxP3、RORγt的蛋白表達 腎臟FoxP3蛋白表達水平比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于SHR組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；腎臟 RORγt蛋白表達水平比較，SHR 組高于WKY組，電針+SHR組低于SHR組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；FoxP3/RORγt蛋白表達的比值組間比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于 SHR 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖 2。

表2 各組大鼠腎臟FoxP3蛋白和RORγt蛋白的相對表達情況（±s）Tab.2 Relative protein expression of FoxP3，RORγt in kidney tissues of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腎臟FoxP3蛋白和RORγt蛋白的相對表達情況（±s）Tab.2 Relative protein expression of FoxP3，RORγt in kidney tissues of rats in each group（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 FoxP3 RORγt FoxP3/RORγt WKY 組 8 0.90±0.30 0.69±0.12 1.25±0.31 SHR 組 8 0.52±0.18* 0.80±0.23 0.69±0.27*電針+SHR 組 8 0.79±0.28# 0.74±0.16 1.21±0.71#

圖2 各組大鼠腎臟組織中FoxP3和RORγt蛋白的相對表達（±s，n=8）Fig.2 Relative expression of FoxP3 and RORγt protein in kidney tissues of rats in each group(±s，n=8)

2.4 大鼠腎臟組織FoxP3和RORγt的mRNA表達 腎臟FoxP3 mRNA表達水平比較，SHR組、電針+SHR組低于 WKY 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；腎臟RORγt mRNA表達水平比較，SHR組高于WKY組，電針+SHR組低于SHR組，差異均有統計學意義（P<0.05）；FoxP3/RORγt mRNA 表達的比值比較，SHR組低于WKY組，電針+SHR組高于SHR組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠腎臟FoxP3和RORγt mRNA的相對表達情況（±s）Tab.3 Relative expression of FoxP3 and RORγt mRNA in kidney tissues of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠腎臟FoxP3和RORγt mRNA的相對表達情況（±s）Tab.3 Relative expression of FoxP3 and RORγt mRNA in kidney tissues of rats in each group（±s）

注：與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 FoxP3 RORγt FoxP3/RORγt WKY 組 8 1.63±0.11 1.55±0.06 1.06±0.11 SHR 組 8 1.50±0.05* 1.80±0.16* 0.84±0.04*電針+SHR 組 8 1.53±0.08* 1.56±0.11# 0.98±0.11#

3 討論

高血壓病前期仍處于萌芽狀態，既可發展成高血壓病，又可在這個階段逆轉，所以高血壓病前期是非常重要的干預介入時點。針刺治療作為中醫學特色療法之一，可疏通經絡氣血，激發人體正氣，調整機體陰陽平衡。石學敏院士提出的“活血散風”針刺降壓法，以人迎和太沖穴為主穴，臨床研究證實降壓效應確切。人迎穴最早載于《靈樞·本輸》，為足陽明胃經經穴，為足陽明少陽之會，與腎、脾、肝、心、三焦、膽、小腸、沖脈、任脈、陰蹺脈等經脈相通，是調節氣海的“營運之輸”，是“氣海”之門戶，有寬胸理氣、調和氣血，調節血壓的功能。太沖為足厥陰之原穴，具有寬胸理氣、平肝息風、活血化瘀、調和氣血陰陽平衡之功。

近年來，越來越多的文獻報道T細胞在原發性高血壓病的發病中發揮重要作用[6]，腎臟、血管壁及血管外周免疫細胞浸潤和炎癥因子的釋放是高血壓病的重要特征[7-8]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮和鹽等刺激中樞和直接作用于腎臟、血管系統，導致血壓輕度上升，此時為高血壓病前期。此期輕微組織損傷、新抗原或損傷相關性分子形成，激活抗原呈遞細胞，發生免疫反應，T淋巴細胞被激活。Th17細胞釋放細胞因子IL-17等，引起前炎性反應，導致血管收縮，促進鈉水吸收，進而促進高血壓病的發展，導致血管重構和心腦腎等重要臟器損害[9-11]。FoxP3是Terg細胞的特異性標志物，該因子不僅對T細胞具有活性調節作用，而且還是體內重要的抗炎因子。研究發現，Tregs的保護性作用可能主要通過FoxP3的直接調節，FoxP3及RORγt分別是Treg和Th17細胞分化的關鍵轉錄因子，敲除RORγt會影響Th17細胞的分化，減輕炎癥反應[12-13]。FoxP3與RORγt的表達異常是導致Treg/Th17失衡的關鍵。研究發現，替米沙坦與瑞舒伐他汀聯合治療可改善高血壓病頸動脈粥樣硬化患者Th17/Treg功能平衡[14]，然而以高血壓病前期大鼠為研究對象，從FoxP3/RORγt失衡角度探索針刺降壓機制的研究鮮有報道。

SHR是通過自然篩選的：1963年日本京都大學醫學院利用有自發性高血壓的Wistar雄性鼠和高血壓水平稍高的雌性Wistar鼠交配，從所得的F1代開始近交篩選，隨著代數增加，自發性高血壓發生率逐漸增大。1969年美國國立衛生研究院（NIH）引入了SHR。SHR除有高血壓自發率為100%特點外，還有高血壓性心血管病變，適于人類的高血壓病研究。本研究結果發現，與WKY組大鼠相比，6周齡高血壓病模型大鼠腎臟組織RORγt mRNA表達升高，FoxP3蛋白和mRNA的表達、FoxP3/RORγt的比值明顯降低，當電針干預后，腎臟組織FoxP3蛋白表達增加，RORγt mRNA表達降低；電針還可提高FoxP3/RORγt的比值，使其趨于正常。結合收縮壓水平的下降，說明FoxP3和RORγt在電針治療低周齡高血壓病大鼠的效應機制中發揮了重要作用。因此，電針可降低高血壓前期大鼠的血壓水平，其機制可能與調節FoxP3/RORγt的動態平衡有關。

高血壓可以直接造成腎臟形態的損害，主要表現為腎小球和腎小管受損[15]。本研究發現6周齡的SHR腎臟形態改變并不十分明顯，其腎小球形態正常，少量腎小管上皮細胞胞質疏松，少量腎小管上皮細胞脫落入管腔。可能與周齡偏小，尚未出現顯著的腎臟損害有關。

SHR是公認的最接近人類原發性高血壓的動物模型，SHR 5周齡后收縮壓開始升高，10周后收縮壓水平顯著上升，20周后收縮壓穩定在較高水平。為了研究電針對高血壓病前期大鼠的效應及其調節機制，故本研究選擇了4～6周齡的SHR大鼠。這與其他關于高血壓前期的研究類似，Liang等[16]采用了4周齡的SHR大鼠，Kvandova M等[17]研究者采用了5周齡的SHR大鼠。

然而本研究也存在不足，由于經費有限，本研究觀察了該周齡段大鼠的FoxP3和RORγt的蛋白和mRNA表達情況，未來可以檢測Treg、Th17細胞及其相關炎癥因子的水平；此外，鑒于2周的干預可能對靶器官損害的改變不明顯，本研究只觀察了干預結束時腎臟組織結構情況，未對干預前后的腎功能進行檢測對比。未來可以增加治療療程及觀察時點，從而從免疫炎癥角度系統闡述電針對高血壓病前期大鼠的效應機制。