甘露消渴膠囊通過JAK2/STAT3信號通路對糖尿病腎病大鼠的影響*

雷虹 ，張葉 ，肖偉利 ，蘇宏泉 ，楊宏昕

（1.內蒙古自治區人民醫院藥學處，呼和浩特 010017；2.河套學院醫學系，巴彥淖爾 015000；3.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特 010017；4.內蒙古自治區人民醫院中醫科，呼和浩特 010017）

糖尿病腎病是糖尿病最重要的合并癥，目前已成為導致終末期腎臟病的重要因素[1]。血糖過高引起腎臟損害的機制主要是促進腎小球基底膜增厚和細胞外基質蓄積，損害腎小球等微血管[2]，主要表現為尿量增多、蛋白尿等[3]。甘露消渴膠囊組方為熟地黃、生地黃、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄參、人參、黨參、黃芪、菟絲子、天花粉、當歸、黃連、白術、桑螵蛸、天冬、麥冬、澤瀉、茯苓。功能滋陰補腎，健脾生津，臨床上主要用于治療非胰島素依賴型糖尿病[4]。本研究旨在觀察甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠的影響，以期為甘露消渴膠囊在臨床上用于治療糖尿病腎病提供實驗依據。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠70只，體質量180～220 g，購于內蒙古大學生命科學學院實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（蒙）2016-0001。大鼠飼養于內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，實驗動物使用許可證號SYXK（蒙）2014-0003，屏障系統內溫度20～25℃，濕度40%～50%，每日光照12 h，光暗循環，實驗期間大鼠自由攝食飲水。

1.2 受試藥物及試劑 甘露消渴膠囊購于吉林省正和藥業集團股份有限公司，批號：180412，規格：每丸質量0.3 g，口服，每日3次，每次5粒。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，口服，每日 2次，每次 1片，每片 0.5 g，批號：abh5048。纈沙坦膠囊：諾華制藥有限公司，口服，每日2次，每次1粒，每粒80 mg，批號：Z2702。TMS-P超敏試劑盒，批號：180625391h；DAB顯色試劑盒，批號：1807240031B，以上試劑購于福建邁新生物技術開發有限公司。蛋白質酪氨酸激酶JAK2抗體（JAK2），批號：bs-0908R；信號轉導和轉錄激活因子3單克隆抗體（STAT3），批號：bsm-33218M，以上抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。檸檬酸，批號：20180521；檸檬酸三鈉，批號：20180604；磷酸鹽緩沖溶液（PBS），批號：20180527；無水乙醇，批號：20180613；水合氯醛，批號：20171211；二甲苯（AR級），批號：20170801，以上試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。鏈脲佐菌素（STZ），批號：SLBB8126V，美國Sigma公司。尿蛋白定量測試盒，批號：180621；尿素氮 （BUN）測試盒，批號：180617；肌酐（Scr）測定試劑盒，批號：180315，以上試劑均購于南京建成生物工程研究所。膽固醇，批號：20180811；膽酸鈉，批號：20180107，以上試劑購于成都華夏化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模、給藥 70只雄性SPF級SD大鼠，隨機選取10只為空白對照組，其余大鼠用高脂高糖飼料（普通飼料66.5%，豬油10%，蔗糖15%，蛋黃7%，膽酸鈉0.5%，膽固醇1%。）喂養4周[5]。4周后大鼠禁食12 h，除空白對照組外其余大鼠腹腔注射經0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.0）配置的STZ（11 mg/mL，5 mL/kg）[6]。繼續維持飼養 4 周后，連續3次隨機血糖＞16.7 mmol/L且24 h尿蛋白≥30 mg/L即為造模成功[7]。本研究中60只造模大鼠，有42只大鼠造模成功，將造模成功的大鼠隨機分為4組，分別為模型組10只、甘露消渴膠囊低劑量組（0.93 g/kg生藥）11只、甘露消渴膠囊高劑量組（1.86 g/kg生藥）11只、二甲雙胍合并纈沙坦組（180mg/kg，14.4mg/kg）10只。各給藥組灌胃體積為10 mL/kg，空白對照組及模型組灌胃等體積蒸餾水，治療給藥8周后測24 h尿蛋白，尾靜脈采血測隨機血糖，10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，檢測血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），最后取腎臟福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化技術檢測JAK2及STAT3在腎組織的表達。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色方法 腎組織經福爾馬林溶液固定24 h后從固定液中取出脫水，石蠟包埋，制作2 μm石蠟切片，進行HE染色。觀察各組大鼠腎臟病理改變[8]。

1.3.3 免疫組化法測定腎臟JAK2及STAT3表達 取相同部位腎組織，石蠟包埋，制作5 μm石蠟切片，切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5 min，消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，10%山羊血清室溫封閉孵育 10 min，傾去血清，滴加一抗（JAK2 1∶200；STAT3 1∶250），4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗，滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，于37℃孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色劑顯，5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，脫水，透明，封片。免疫組化圖片采用ImageJ軟件進行灰度值分析，根據灰度值計算光密度值（OD），OD=log[gv0/gv）][9]。

1.4 統計學方法 所有數據采用SPSS 22.0統計處理，結果以均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD檢驗，相關性分析采用Pearson線性相關。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機血糖的影響 與空白對照組比較模型組隨機血糖顯著升高（P<0.01），與模型組比較甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組、二甲雙胍合并纈沙坦組隨機血糖顯著降低（P<0.01）。見表1。

表1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機血糖的影響（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

表1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機血糖的影響（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動物數 劑量 治療后隨機血糖（mmol/L）空白對照組 10 - 5.34±0.51模型組 10 - 21.34±1.43*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 17.98±1.80#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 16.43±1.22#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 14.24±2.00#

2.2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、血Scr及血BUN的影響 與空白對照組比較模型組尿蛋白、血Scr及血BUN含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組和二甲雙胍合并纈沙坦組尿蛋白、Scr及BUN含量顯著降低（P<0.01）。見表2。

表2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影響（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

表2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影響（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別動物數劑量尿蛋白（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）空白對照組 10 - 8.22±1.07 41.10±5.39 6.21±1.07模型組 10 - 49.82±3.01* 69.92±3.01* 12.49±0.82*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 38.76±3.79# 54.76±3.79# 8.17±0.68#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 32.51±2.57# 52.51±2.57# 8.40±0.78#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 29.91±4.20# 49.91±4.20# 8.62±1.33#

2.3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理損傷的影響 腎臟HE染色結果顯示空白對照組大鼠腎小球大小正常，形態規整，腎間質未見炎癥浸潤，系膜區無可見增生，腎小管結構完整，排列整齊；模型組大鼠腎臟的腎小球明顯增大，系膜細胞增殖，系膜基質增加，腎小管上皮細胞存在空泡（圖中黑色尖頭所指處）；與模型組比，甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組及陽性藥物對照組大鼠腎小球形態趨于正常，基底膜輕微增生，腎小管排列趨于完整，較模型組病變程度明顯減輕，見圖1。

圖1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟病理損傷的影響（×400）Fig.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on renal pathological damage in diabetic nephropathy rats(×400)

2.4 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達的影響 與空白對照組比較，模型組腎臟組織JAK2及STAT3表達顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組和二甲雙胍合并纈沙坦組腎臟組織JAK2及STAT3表達顯著降低（P<0.01）。見表 3、圖 2、圖 3。

圖2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2表達的影響（×400）Fig.2 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on JAK2 expression in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

圖3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織STAT3表達的影響（×400）Fig.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

表3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

表3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動物數 劑量 JAK2 OD值 STAT3 OD值空白對照組 10 - 0.128±0.020 0.098±0.019模型組 10 - 0.329±0.017* 0.301±0.019*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 0.252±0.023# 0.222±0.032#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 0.230±0.023# 0.203±0.020#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4mg/kg 0.186±0.020# 0.179±0.035#

2.5 各組大鼠隨機血糖與尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表達的相關性分析 Pearson相關分析顯示各組大鼠隨機血糖與24 h尿蛋白量、血BUN含量、血Scr含量、JAK2及STAT3在腎組織的表達之間具有相關性，呈正相關（P＜0.01）。見表4。

表4 各組組大鼠隨機血糖與尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表達相關性分析Tab.4 Correlation analysis of random blood glucose and urinary protein，Scr，BUN，JAK2 and STAT3 expression in each group

3 討論

糖尿病腎臟病變是糖尿病最嚴重的并發癥，其主要病變為腎小球硬化癥，糖尿病腎臟病是以血管損害為主的腎小球病變[10]。糖尿病的早期腎臟體積增大，腎小球呈高濾過狀態，腎小球組織蛋白的非酶糖化可改變腎小球基底膜和系膜區基質蛋白的特性，使腎小球基底膜通透性增加、腎小球基底膜增厚[11]。逐漸出現微量白蛋白尿，隨著糖尿病病程的延長出現持續蛋白尿、腎小球濾過率降低等癥狀[12]。控制血糖可改善異常的腎血流動力學，延緩微量蛋白尿的出現，使已有微量蛋白尿的患者轉為明顯臨床蛋白尿的情況明顯減少。高血壓是導致糖尿病腎病發生和發展的重要因素。血管緊張素轉化酶抑制劑，可以改善腎內血流動力學、減少尿蛋白排出，抑制系膜細胞、成纖維細胞和巨噬細胞活性，改善濾過膜通透性[13]。甘露消渴膠囊由熟地黃、生地黃、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄參、人參、黨參、黃芪、菟絲子、當歸、黃連、天花粉、白術、桑螵蛸、天冬、麥冬、澤瀉、茯苓組成，有研究表明其中的天花粉、地骨皮、澤瀉、黃連具有明確的降血糖作用；地骨皮、山茱萸具有可靠地降血壓作用，人參、黨參、黃芪、當歸具有顯著的預防血管損傷及改善微循環的作用，以上藥理作用均能有效延緩糖尿病腎臟病的發生、發展。糖尿病腎病發病機制尚未完全闡明，近年來炎癥反應在其發病機制中的作用受到重視，高血糖可使腎實質細胞合成多種細胞因子如結締組織生長因子、胰島素樣生長因子-1、腫瘤壞死因子、白介素-6（IL-6）等[14]，其中 IL-6 與細胞膜上 IL-6 受體結合后能誘導JAK2/STAT3信號通路的活化，進而促進炎癥反應的發生并促進血管內皮細胞的增殖，引起腎小球血管通透性增強，腎小球的濾過膜損傷。腎小球損傷后產生蛋白尿誘使腎小球增殖肥大的形成。本研究表明甘露消渴膠囊可顯著降低糖尿病腎病大鼠JAK2及STAT3在腎臟組織表達，減輕糖尿病引起的腎小球增大及基底膜增生，降低尿蛋白、Scr及BUN含量，且上述藥理作用均與甘露消渴膠囊降低血糖作用呈正相關。

綜上所述，甘露消渴膠囊可通過降低糖尿病大鼠隨機血糖以及調控JAK2、STAT3在腎臟組織的表達，減輕高血糖對腎組織的病理損傷，改善腎功能，起到對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用的作用。