四君子湯合痛瀉要方對(duì)感染后腸易激綜合征肝郁脾虛證小鼠腸道免疫及黏膜屏障功能的影響*

王文峰，司會(huì)強(qiáng)，方妹輝

（珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，珠海 519000）

腸易激綜合征（IBS）是一種反復(fù)發(fā)作的功能性腸病，以腹脹、腹痛、大便習(xí)慣改變?yōu)橹饕Y狀[1]。其中約有3.7%～36%的IBS患者既往有急性感染性胃腸炎病史，這種在腸道感染后形成的IBS即感染后腸易激綜合征（PI-IBS）[2]。目前研究表明，PI-IBS的發(fā)生發(fā)展與腸道免疫功能異常、腸道通透性改變及腸黏膜低度炎癥密切相關(guān)[3]。腸道感染所引起的腸黏膜免疫功能異常在PI-IBS發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，以輔助性T細(xì)胞（Th1）型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)的免疫失衡還可引起腸黏膜緊密連接蛋白下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間通透性增加，加重腸黏膜損傷[4]。PI-IBS可歸屬于中醫(yī)“腹痛”“瀉泄”等范疇，臨床以肝郁脾虛證型最為常見(jiàn)，治療以抑肝扶脾、祛濕止瀉為原則，多用四君子湯合痛瀉要方加減[5]。然而，目前PI-IBS的動(dòng)物模型多以感染細(xì)菌、寄生蟲(chóng)進(jìn)行誘導(dǎo)，中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型尚缺乏統(tǒng)一的建立標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在旋毛蟲(chóng)感染NIH小鼠的基礎(chǔ)上，采用慢性束縛應(yīng)激+過(guò)度疲勞+飲食失節(jié)的復(fù)合方法復(fù)制小鼠PIIBS肝郁脾虛證模型，應(yīng)用四君子湯合痛瀉要方灌胃治療，觀察其在PI-IBS肝郁脾虛證小鼠急性及慢性感染期中的治療作用，并探討其通過(guò)調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞免疫平衡，保護(hù)腸黏膜屏障功能而發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NIH小鼠50只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，室內(nèi)保持12 h光照與黑暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 旋毛蟲(chóng)活體幼蟲(chóng)購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所；四君子湯合痛瀉要方組成為黨參15 g，茯苓 15 g，白術(shù) 15 g，陳皮 10 g，防風(fēng) 15 g，白芍15 g，枳殼10 g，炙甘草5 g。參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算小鼠灌胃等效劑量為13 g/kg。臨用前生理鹽水稀釋至終濃度為1.3 g/mL，按0.01 mL/g灌胃給藥。干擾素（IFN-γ）、白介素-10（IL-10）、白介素-17（IL-17）小鼠酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自北京市福瑞生物工程公司；閉合蛋白（occludin）、緊密粘連蛋白-1（ZO-1）一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 模型建立 參考肝郁證模型的慢性束縛應(yīng)激法和脾虛證模型的過(guò)度勞累加饑飽失常法[6-7]，采用慢性束縛應(yīng)激+過(guò)度疲勞+飲食失節(jié)方法建立NIH小鼠肝郁脾虛證模型：實(shí)驗(yàn)前全部小鼠進(jìn)行預(yù)游泳，剔除游泳時(shí)間少于10 min或大于20 min的小鼠，將合格的造模小鼠每日上午8∶00放置于束縛盒中3 h限制活動(dòng)，每日下午2∶00放置于盛水塑料桶[水溫（22±1）℃]中游泳 10 min。隔日喂食，連續(xù)3周，觀察1周。旋毛蟲(chóng)感染制備PI-IBS模型：于實(shí)驗(yàn)第5周應(yīng)用旋毛蟲(chóng)感染小鼠，每只小鼠灌胃含400～500個(gè)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的0.9%生理鹽水0.2 mL，感染后2周為急性感染期，感染8周后為PI-IBS期，腸道無(wú)明顯炎癥，內(nèi)臟敏感性明顯增高為造模成功。

1.4 分組與給藥 將NIH小鼠隨機(jī)分為空白組、感染2周組、感染8周組、2周治療組、8周治療組，共5組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠采用慢性束縛應(yīng)激+過(guò)度疲勞+飲食失節(jié)+旋毛蟲(chóng)感染建立PI-IBS肝郁脾虛證模型，感染2周組、感染8周組除造模外不予其他干預(yù)，以感染后2周、8周為時(shí)間點(diǎn)處死小鼠用作實(shí)驗(yàn)；2周治療組于感染2周后給予四君子湯合痛瀉要方灌胃治療6周；8周治療組于感染8周后給予四君子湯合痛瀉要方灌胃治療6周；空白組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

2 觀察指標(biāo)

2.1 一般狀況及臨床表征觀察 參考肝郁脾虛證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型相關(guān)特點(diǎn)[8]觀察并記錄小鼠主要表現(xiàn)：毛發(fā)疏松，毛色枯焦無(wú)光，乏力，倦怠，喜扎堆，弓背等一般狀態(tài)改變；伴隨情緒不穩(wěn)，灌胃抵抗，易怒，興奮程度減低，飲食飲水量減少，大便不成形，便質(zhì)稀溏等變化。

2.2 內(nèi)臟敏感性檢測(cè) 小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24h，經(jīng)乙醚麻醉后，將帶氣囊的導(dǎo)管經(jīng)小鼠肛門(mén)插入約2 cm，待小鼠適應(yīng)30 min后開(kāi)始檢測(cè)。向氣囊內(nèi)隨機(jī)注入空氣，達(dá)到目標(biāo)容量后持續(xù)20 s，觀察腹壁回撤反應(yīng)（AWR）并進(jìn)行評(píng)分，每一容量下重復(fù)3次，取平均值。由0.25 mL開(kāi)始，隨后每隔5 min分別遞增至0.35、0.5、0.65 mL。AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)張時(shí)無(wú)反應(yīng)者記為0分；擴(kuò)張時(shí)出現(xiàn)輕微頭部運(yùn)動(dòng)，而身體無(wú)反應(yīng)者記為1分；擴(kuò)張時(shí)腹部肌肉收縮而未抬離桌面者記為2分；擴(kuò)張時(shí)腹部肌肉收縮且抬離桌面者記為3分；擴(kuò)張時(shí)身體呈弓形，骨盆抬起者記為4分。

2.3 糞便含水百分?jǐn)?shù)檢測(cè) 連續(xù)收集各組小鼠8 h糞便，稱取每只小鼠每隔2 h的糞便質(zhì)量，隨后將糞便置于65℃烘箱中過(guò)夜干燥，再次稱量糞便干質(zhì)量，計(jì)算小鼠糞便含水百分?jǐn)?shù)。

2.4 腸道組織病理學(xué)觀察 各組小鼠摘眼球取血并處死，解剖后取部分末端回腸、近端結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗去除腸內(nèi)容物，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片機(jī)5 μm切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)改變，并對(duì)各組小鼠進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：固有層未見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)無(wú)明顯水腫為正常，記為0分；固有層僅見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)輕度水腫為輕度，記為1分；固有層可見(jiàn)中等量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)呈中度水腫為中度，記為2分；固有層及整個(gè)黏膜層可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)重度水腫或壞死為重度，記為3分。

2.5 血清細(xì)胞因子含量檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-10、IFN-γ、IL-17細(xì)胞因子水平。各組小鼠眼球取血，3 000 r/min，離心15 min，離心半徑8 cm，分離血清，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔按標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度各加入50 μL；樣品孔加入血清樣品 10 μL，樣品稀釋液 40 μL，空白孔不加；標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔各加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體100 μL，空白孔不加，封板膜封住反應(yīng)孔后，置于37℃恒溫箱中孵育1 h；棄去液體，洗板6次，每次 1 min，每孔加入顯色液 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL，于酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)各反應(yīng)孔OD值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本IL-10、IFN-γ、IL-17 含量。

2.6 腸道組織中IL-10、IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠結(jié)腸組織，采用Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min 1個(gè)循環(huán)，95℃變性10 s，退火溫度60℃30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 7 min，56 ℃ 30 s。結(jié)果以 2-ΔΔCt法分析 IL-10、IFN-γ、IL-17的相對(duì) mRNA 表達(dá)量。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

2.7 腸道組織中occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠結(jié)腸組織，勻漿后加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入10 μL蛋白樣品，電泳分離，冰上轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，occludin、ZO-1一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，滴加顯影液，凝膠成像并拍照后用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較，組間兩兩比較采用LSD檢測(cè)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況及臨床表征變化 空白組小鼠精神狀態(tài)正常，動(dòng)作靈活，毛色光澤，不喜扎堆，進(jìn)食及飲水量正常，二便正常，糞便呈球形，干濕適中。感染2周組小鼠出現(xiàn)易怒表現(xiàn)，灌胃時(shí)劇烈抵抗，毛發(fā)豎立，少動(dòng)喜聚集，飲食及飲水量減少，大便稀溏不成形。感染8周后小鼠情緒逐漸轉(zhuǎn)為低落，毛發(fā)枯亂無(wú)光，喜聚集，大便質(zhì)地稀溏，較感染2周時(shí)稍干。2周治療組、8周治療組小鼠精神狀態(tài)及大便形態(tài)較治療前均有明顯改善，小鼠毛發(fā)整齊，恢復(fù)光澤，時(shí)喜扎堆，飲食及飲水量較前增多，大便呈球型。

3.2 各組小鼠AWR評(píng)分比較 各組小鼠的AWR評(píng)分均隨著氣囊內(nèi)空氣體積的增加而增高。當(dāng)注入空氣體積為0.35 mL和0.5 mL時(shí)，感染后2周及感染后8周組小鼠AWR評(píng)分較空白組顯著升高（P＜0.05），2周治療組、8周治療組小鼠評(píng)分明顯低于感染后2周及感染后8周組（P＜0.05）。注入空氣體積為0.25 mL和0.65 mL時(shí)，各組小鼠AWR評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 各組小鼠AWR評(píng)分比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR scores of mice in each group（±s） 分

表2 各組小鼠AWR評(píng)分比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR scores of mice in each group（±s） 分

注：與空白組比較，*P＜0.05；與感染 2 周組比較，#P＜0.05；與感染 8 周組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 空氣體積0.25 mL 0.35 mL 0.5 mL 0.65 mL空白組 10 0.36±0.24 1.15±0.39 2.31±0.44 3.74±0.60感染 2周組 10 0.57±0.29 2.63±0.41* 3.87±0.69*3.88±0.54感染 8 周組 10 0.54±0.32 2.40±0.53* 3.65±0.52*3.72±0.49 2 周治療組 10 0.52±0.45 1.78±0.46# 2.78±0.40#3.75±0.62 8 周治療組 10 0.43±0.37 1.52±0.38△ 2.53±0.63△ 3.71±0.35

3.3 各組小鼠糞便含水百分?jǐn)?shù)比較 與空白組相比，感染2周組及感染8周組小鼠每2 h糞便含水百分?jǐn)?shù)均顯著增高（P＜0.05），2周治療組小鼠每2 h糞便含水百分?jǐn)?shù)較感染后2周組明顯降低，8周治療組每2 h糞便含水百分?jǐn)?shù)較感染后8周組明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表3 各組小鼠糞便含水百分?jǐn)?shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of water content in feces of mice in each group（±s）%

表3 各組小鼠糞便含水百分?jǐn)?shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of water content in feces of mice in each group（±s）%

注：與空白組比較，*P＜0.05；與感染 2 周組比較，#P＜0.05；與感染 8 周組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 2 h 4 h 6 h 8 h空白組 10 30.76±6.71 33.94±8.32 38.16±7.24 40.25±8.04感染 2 周組 10 55.28±5.87* 62.47±6.19* 67.38±9.71* 73.94±8.69*感染 8 周組 10 42.04±7.45* 48.65±6.70* 54.82±7.48* 58.81±7.26*2 周治療組 10 43.74±7.72# 49.60±6.93# 53.17±8.24# 60.58±6.07#8周治療組 10 34.05±5.87△ 37.93±7.41△ 43.42±6.55△ 47.38±8.59△

3.4 各組小鼠腸道組織病理學(xué)變化 見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果可見(jiàn)，空白組小鼠回腸、結(jié)腸黏膜各層結(jié)構(gòu)完整，黏膜下未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。感染2周組小鼠回腸、結(jié)腸組織染色顯示明顯炎癥性改變，可見(jiàn)黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，黏膜及黏膜下層明顯充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于空白組（P＜0.05）。而感染8周組小鼠回腸、結(jié)腸組織未見(jiàn)明顯炎性損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)評(píng)分與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng)2周治療組灌胃治療后，小鼠回腸、結(jié)腸組織損傷明顯減輕，黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較感染2周組顯著減少，病理學(xué)評(píng)分明顯低于感染2周組（P＜0.05）。感染8周組小鼠回腸、結(jié)腸組織未見(jiàn)明顯炎性損傷，病理學(xué)評(píng)分與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠腸組織病理改變（HE染色，×200）Fig.1 Pathological changes of intestinal tissue in mice of each group（HE staining，×200）

3.5 各組小鼠血清中IL-10、IFN-γ、IL-17細(xì)胞因子含量比較 與空白組比較，感染2周組、感染8周組小鼠血清中IFN-γ及IL-17的含量均顯著升高，IL-10的含量顯著降低（P＜0.05）。2周治療組、8周治療組小鼠血清中IFN-γ、IL-17水平明顯低于感染后 2周及感染后 8周組（P＜0.05），IL-10水平較感染后2周及感染后8周組明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清中IL-10、IFN-γ、IL-17含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-10，IFN-γ and IL-17 in serum of mice in each group（±s）ng/mL

表4 各組小鼠血清中IL-10、IFN-γ、IL-17含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-10，IFN-γ and IL-17 in serum of mice in each group（±s）ng/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與感染 2 周組比較，#P＜0.05；與感染8 周組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-10 IFN-γ IL-17空白組 10 25.34±6.07 19.38±4.15 9.58±2.64感染 2 周組 10 11.21±4.92* 45.86±7.46* 24.87±6.90*感染 8 周組 10 15.46±7.94* 38.59±6.05* 18.83±8.47*2 周治療組 10 18.39±7.05# 30.19±8.65# 16.09±5.71#8 周治療組 10 20.75±5.26△ 25.63±6.94△ 12.55±4.86△

3.6 腸道組織中IL-10、IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá) 與空白組相比，感染2周組、感染8周組小鼠結(jié)腸組織中IFN-γ及IL-17的mRNA表達(dá)顯著增加，IL-10的mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。2周治療組、8周治療組IFN-γ及IL-17的mRNA表達(dá)較感染后 2周及感染后 8周組明顯減少（P＜0.05），IL-10的 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表 5。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中IL-10、IFN-γ、IL-17 mRNA比較（±s）Tab.5 Comparison of IL-10，IFN-γ and IL-17 mRNA in colon tissue of mice in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與感染 2 周組比較，#P＜0.05；與感染 8 周組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-10 IFN-γ IL-17空白組 10 1.01±0.01 1.01±0.01 1.01±0.01感染 2 周組 10 0.25±0.13* 3.33±0.51* 3.26±0.47*感染 8 周組 10 0.38±0.42* 2.99±0.36* 2.53±0.30*2 周治療組 10 0.49±0.24# 1.71±0.28# 1.89±0.23#8周治療組 10 0.62±0.17△ 0.31±0.25△ 1.42±0.15△

3.7 各組小鼠腸道組織中occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)情況比較 感染后2周組小鼠結(jié)腸組織中occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)較空白組顯著降低（P＜0.05），至感染8周后表達(dá)有所增強(qiáng)，但仍顯著低于空白組（P＜0.05）。2 周治療組、8 周治療組 occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)較感染2周及感染8周組顯著增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of occludin and ZO-1 in mouse colon

4 討論

PI-IBS常可見(jiàn)腸道免疫功能異常，炎性細(xì)胞因子分泌增多，腸黏膜低度炎癥等病理改變。研究表明[9-10]，PI-IBS患者腸黏膜處于免疫激活狀態(tài)，黏膜內(nèi)T淋巴細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子分泌增多，這些炎性因子的過(guò)度分泌能夠刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)，引起內(nèi)臟高敏感性，繼而導(dǎo)致腹痛及大便習(xí)慣的改變。促炎和抗炎細(xì)胞因子的平衡失調(diào)能夠影響腸道生理和免疫功能，從而導(dǎo)致PI-IBS癥狀出現(xiàn)。如輔助性T細(xì)胞亞群Th1釋放IFN-γ等促炎細(xì)胞因子以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，IFN-γ的過(guò)度升高可破壞腸上皮細(xì)胞，使黏膜屏障功能受損，腸道緊密連接通透性增加[11-12]。Th2細(xì)胞表達(dá)IL-10等抑炎因子以調(diào)節(jié)自身免疫，防止過(guò)度炎癥反應(yīng)，IL-10的減少能夠引起促炎和抗炎機(jī)制的平衡失調(diào)，導(dǎo)致腸道慢性炎癥[13]。而由Th17細(xì)胞所分泌的IL-17能夠誘導(dǎo)自身免疫，IL-17與IFN-γ還能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)腸道黏膜炎癥反應(yīng)[14]。腸上皮間的緊密連接蛋白在保護(hù)腸黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)腸道通透性中起著關(guān)鍵作用[15]。研究表明[4]，腸道感染所引起的以Th1型細(xì)胞占主導(dǎo)的免疫失衡可能引起腸黏膜緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞間通透性增加，加重腸黏膜損傷。Occludin具有細(xì)胞旁屏障功能，能夠封閉細(xì)胞間隙，形成細(xì)胞間緊密連接的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。ZO-1被看作緊密連接的橋梁蛋白，有連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的作用。其表達(dá)水平的變化可作為觀察黏膜屏障功能與細(xì)胞通透性的指標(biāo)[16-17]。

PI-IBS可歸屬于中醫(yī)“腹痛”“瀉泄”等范疇，其病位在腸，脾虛濕困為病機(jī)關(guān)鍵，同時(shí)與肝、腎等臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)。肝郁脾虛證為PI-IBS最常見(jiàn)的臨床證型，可占50%以上[5]。多因飲食不節(jié)、七情內(nèi)傷等導(dǎo)致氣機(jī)不利，肝郁氣滯，肝氣橫逆侮脾，脾胃受損，升降失職，致小腸清濁不分，水谷相雜并走大腸而成泄瀉。治療以抑肝扶脾、祛濕止瀉為原則，有效方劑多用四君子湯合痛瀉要方加減[18]。方中黨參甘溫入脾，健脾益胃，白術(shù)苦溫，健脾同時(shí)亦可燥濕，共為君藥；白芍酸甘而微寒，既可養(yǎng)陰柔肝，合甘草又有緩急止痛之效，為臣藥；茯苓滲濕補(bǔ)脾，促脾之運(yùn)化，陳皮、枳殼疏肝理氣，使補(bǔ)而不滯，共為佐藥；防風(fēng)有升發(fā)之性，合陳皮能散肝郁而舒脾氣，為佐使藥；使以炙甘草甘溫和中，調(diào)和諸藥。全方合用，共奏瀉肝補(bǔ)脾、祛濕止瀉之效。

目前PI-IBS的動(dòng)物模型多以感染細(xì)菌、寄生蟲(chóng)進(jìn)行誘導(dǎo)，而中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型尚缺乏統(tǒng)一的建立標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在旋毛蟲(chóng)感染NIH小鼠的基礎(chǔ)上，借鑒肝郁證[6]及脾虛證[7]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法，采用慢性束縛應(yīng)激+過(guò)度疲勞+飲食失節(jié)的復(fù)合方法復(fù)制小鼠PI-IBS肝郁脾虛證模型，應(yīng)用四君子湯合痛瀉要方灌胃治療，觀察其在PI-IBS肝郁脾虛證小鼠急性及慢性感染期中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染2周組小鼠出現(xiàn)易怒表現(xiàn)，排便次數(shù)增加、大便稀溏不成形，至感染8周后，小鼠情緒逐漸轉(zhuǎn)為低落，大便質(zhì)地較感染2周時(shí)稍干。形態(tài)學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，感染后2周小鼠腸道處于急性炎癥期，回腸、結(jié)腸組織均可見(jiàn)明顯炎性損傷；至感染后8周，小鼠腸黏膜炎癥消退，組織形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，提示此時(shí)旋毛蟲(chóng)一過(guò)性感染導(dǎo)致的腸道感染在病理學(xué)上己基本恢復(fù)，和人類PI-IBS病變類似。而感染8周組小鼠AWR評(píng)分及糞便含水百分?jǐn)?shù)較空白組仍顯著增高，提示小鼠內(nèi)臟高敏感性和腸動(dòng)力功能異常仍然存在，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功。四君子湯合痛瀉要方給藥治療后，感染2周組小鼠結(jié)腸、回腸組織病理?yè)p傷明顯減輕，感染后2周、8周組小鼠AWR評(píng)分及糞便含水百分?jǐn)?shù)顯著改善，提示四君子湯合痛瀉要方在旋毛蟲(chóng)感染所致PI-IBS急性及慢性感染期中均具有明顯的治療作用。ELISA及RT-PCR結(jié)果均顯示，感染后2周、8周組小鼠血清及結(jié)腸組織中IFN-γ和IL-17的表達(dá)明顯升高，IL-10的表達(dá)降低。IFN-γ和IL-17水平的升高能夠抑制IL-10的表達(dá)水平，導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)持續(xù)活化，可能是造成PI-IBS小鼠癥狀持續(xù)存在的原因之一[19]。四君子湯合痛瀉要方干預(yù)后，小鼠血清及結(jié)腸組織中IFN-γ、IL-17的表達(dá)均明顯降低，同時(shí)上調(diào)了IL-10的表達(dá)，說(shuō)明四君子湯合痛瀉要方能夠調(diào)節(jié)旋毛蟲(chóng)感染所引起的免疫失衡，從而改善PI-IBS小鼠癥狀。感染后2周組小鼠結(jié)腸組織中occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)顯著降低，至感染后8周組表達(dá)有所增強(qiáng)，但仍顯著低于空白組，提示在旋毛蟲(chóng)感染建立的PI-lBS模型中存在腸黏膜緊密連接蛋白的異常變化。經(jīng)四君子湯合痛瀉要方干預(yù)后，occludin、ZO-1的表達(dá)較治療前明顯增高，提示四君子湯合痛瀉要方治療能夠上調(diào)腸黏膜緊密連接蛋白的表達(dá)，保護(hù)腸黏膜屏障功能。

綜上所述，本研究表明四君子湯合痛瀉要方對(duì)PI-IBS肝郁脾虛證小鼠急性及慢性感染期均具有明顯的治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞因子免疫失衡，從而恢復(fù)腸黏膜緊密連接蛋白的表達(dá)水平，保護(hù)腸黏膜屏障功能，降低腸黏膜通透性，改善PI-IBS小鼠癥狀。