黃芩素衍生物對大鼠急性肝性腦病模型的干預(yù)*

范栢爽 ，吳梓君 ，劉世豪 ，李思勤 ，王麗莉 ，何新 ，

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.廣東藥科大學(xué)，廣州 510006）

肝性腦病又稱肝昏迷，是由肝功能嚴重障礙和/或門靜脈—體循環(huán)分流異常引起的腦功能障礙，表現(xiàn)為一系列從亞臨床改變到昏迷程度不等的神經(jīng)精神異常綜合征，包括認知功能、情緒、行為和運動功能的異常改變[1-2]。臨床上主要分為A、B、C 3型，其中A型是由于急性肝衰竭導(dǎo)致的肝性腦病，其特點為起病急、病程長、病死率高達80%[3]。目前肝性腦病的治療主要為去除誘因、脫氨、人工肝及肝移植，已取得較好的治療效果[4]，但各有其局限性，因此探索新的預(yù)防及治療方法有重要的現(xiàn)實意義。

黃芩素，是從中藥黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根分離出來的黃酮類單體化合物，是黃芩中最主要的活性成分之一，也是主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。現(xiàn)代研究表明黃芩素具有許多藥理活性，如抗病毒、抗菌、清除自由基、抗過敏、治療癌癥等[7]。此外，黃芩素還具有較好的保肝和神經(jīng)保護作用，有研究顯示黃芩素對四氯化碳（CCl4）、藥物等誘導(dǎo)的許多急慢性肝炎、肝纖維化和肝癌有良好的防治作用，對神經(jīng)毒性有較強的神經(jīng)保護作用[8-9]。但由于其生物利用度低、水溶性差，限制了其臨床應(yīng)用[10]。有報道，對黃芩素進行磺酸化改造后，應(yīng)用到CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷實驗中，結(jié)果與黃芩素相比，磺酸化黃芩素有更好的保肝效果，且增加其體內(nèi)吸收量[11]。A型肝性腦病模型有多種，在藥物誘導(dǎo)方法中，硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)的動物模型，具有可重復(fù)性、易觀察分期、成功率高、與人類肝性腦病相似度高等優(yōu)點[12]。故本研究采用TAA法誘導(dǎo)大鼠急性肝性腦病模型，探討黃芩素衍生物二磺酸基黃芩素（DB）對急性肝性腦病大鼠的干預(yù)作用及其可能的作用機制，以期為肝性腦病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級Wistar雄性大鼠，72只，體質(zhì)量220～240 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號[SCXK（京）2016-0006]，動物批號1100112011037688，于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)，動物實驗室許可證號SYXK（津）2018-0008。飼養(yǎng)條件：溫度20～25℃，濕度40%～60%，每日光照12 h，自由攝食飲水，均用標準飼料。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。所有實驗符合天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 實驗藥物與試劑 DB（實驗室自制，經(jīng)核磁測定純度高于98%[13]）；硫代乙酰胺（上海生工生物工程股份有限公司，批號F514BA0026）；乳果糖口服溶液（北京韓美藥品有限公司，批號20050006）；γ-氨基丁酸（GABA）試劑盒（美國MyBiosource公司，批號 36361656）；谷氨酸（Glu）試劑盒（美國MyBiosource公司，批號20200929C）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（美國 R&D Systems公司，批號 P219559）；白介素-6（IL-6）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號X23014810）；BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20200817）；β-肌動蛋白/β-Actin（內(nèi)參）抗體，羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為AG07197903、BJ05217694）；磷脂酰肌醇 3激酶（PI3K）抗體（萬類生物科技有限公司，批號I05182196）；磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號23）。

1.3 主要儀器 DB001 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司；NX10N快速血氨測定儀，日本Fujifilm公司；7020型全自動生化分析儀，日本Hitach公司；Microfuge-22R型高速離心機，美國Beckman公司；AX205型十萬分之一天平，瑞士Mettler Toledo公司；GL-88B渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PowerPac型電泳儀，美國Bio-Rad公司；VILBER Fusion FX5凝膠成像儀，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；FE28型FiveEasy Plus臺式pH計，上海屹利科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組12只，分別為對照組，模型組，DB 低、中、高劑量（6.25、25、100 mg/kg，給藥劑量為前期的預(yù)實驗結(jié)果）組和陽性藥（乳果糖，6 g/kg）組。DB組和陽性藥組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，對照組和模型組均灌胃等體積生理鹽水。于給藥第6天開始造模，除對照組外，各組大鼠均腹腔注射硫代乙酰胺（TAA，300 mg/kg[14]）1 次，連續(xù) 2 d，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。造模期間，為防止大鼠發(fā)生電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，從首次腹腔注射TAA后，每12 h皮下注射3 mL 10%葡萄糖、2 mL生理鹽水和20 μmol氯化鉀的等量混合液。末次腹腔注射TAA后將全部大鼠禁食12 h，次日以10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，于冰上迅速取肝、腦組織。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠一般狀態(tài)、分期評分及死亡率 觀察各組大鼠在造模前后精神狀態(tài)、毛色、活動、死亡情況并記錄。根據(jù)大鼠肝性腦病診斷標準[15]，若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主活動減少、共濟失調(diào)、昏迷等癥狀之一，則可診斷為肝性腦病，并根據(jù)Zimmermann法[15]對大鼠肝性腦病分級進行評分，見表1。

表1 肝性腦病的分級評分標準Tab.1 Grading and scoring standards for hepatic encephalopathy

2.2.2 行為學(xué)檢測 將水注入直徑130cm、高50cm的圓形黑色內(nèi)壁水池中，水深25 cm、水溫（25±1）℃，水下1.5 cm處放置黑色平臺（8 cm×8 cm），池壁上貼有不同顏色的 4 個數(shù)字：1、2、3、4，它們將水池平分為4個象限。測試前1 d將所有大鼠放入水池中自由游泳90 s。隨后將所有大鼠每天訓(xùn)練4次，每次90 s，共訓(xùn)練5 d，將大鼠頭朝向池壁依次從4個象限入水，當90 s已到或大鼠已找到平臺，停止錄像，并讓大鼠在平臺上休息20 s，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間（尋臺潛伏期），未找到平臺的大鼠記為90 s。于第6天，記錄大鼠尋臺潛伏期和撤掉平臺后90 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)（即穿環(huán)指數(shù)）。

2.2.3 血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH測定 末次腹腔注射TAA 24 h后進行取眼眶血，應(yīng)用快速血氨測定儀檢測大鼠全血中氨的含量。取大鼠回盲腸后端結(jié)腸大約10 cm，采用pH計法檢測結(jié)腸內(nèi)容物pH值。

2.2.4 血清及肝生化指標測定 采用全自動生化儀檢測血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBiL）的濃度。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清中TNF-α和IL-6水平。

2.2.5 肝組織病理檢查 剪取肝組織左葉，置于4%多聚甲醛中固定，脫水、包埋和切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察肝臟病理變化。

2.2.6 神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測 稱取大鼠前額葉皮質(zhì)組織，制成10%的勻漿，按照試劑盒說明書測定前額葉皮質(zhì)中GABA和谷氨酸含量。

2.2.7 蛋白免疫印跡法檢測大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K，p-AKT蛋白的表達 取各組大鼠前額葉皮質(zhì)組織，加入細胞裂解液，裂解后離心取上清液，采用BCA定量試劑盒法進行蛋白測定。然后進行SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1 h后使用化學(xué)發(fā)光劑曝光，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進行結(jié)果計算。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用Tukey法進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠一般狀態(tài)、分期評分及死亡率的影響對照組大鼠活動無異常，神經(jīng)反射靈敏。模型組大鼠首次腹腔注射TAA 24 h后，出現(xiàn)食欲下降，行動減緩，皮毛疏松；第2次腹腔注射TAA 24 h后，大鼠體毛明顯變黃，呼吸頻率加快，步態(tài)不穩(wěn)，共濟失調(diào)，甚至昏迷。各給藥組大鼠活動減少、行動遲緩、昏迷等情況較模型組有改善。與模型組相比，DB低、中、高劑量組均可顯著改善肝性腦病大鼠分級評分（P＜0.01），且可顯著降低死亡率。見表 2。

表2 大鼠肝性腦病評分和死亡率比較Tab.2 Comparison of hepatic encephalopathy score and mortality of rats

3.2 對大鼠尋臺潛伏期與穿環(huán)指數(shù)的影響 比較各組大鼠在造模0 h尋臺潛伏期，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明組間具有可比性。末次腹腔注射TAA 24 h后，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，DB低、中、高劑量組均能明顯降低大鼠尋臺潛伏期（P＜0.05）；DB中、高劑量組能明顯增加穿環(huán)指數(shù)（P＜0.01 或 P＜0.05）。可以推測DB可改善肝性腦病大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，見表3。

表3 不同時間段各組大鼠尋臺潛伏期和穿環(huán)指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of seeking latency and piercing index of rats in different periods（±s）

表3 不同時間段各組大鼠尋臺潛伏期和穿環(huán)指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of seeking latency and piercing index of rats in different periods（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.3 對血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH的影響 與對照組相比，模型組大鼠血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH水平均顯著升高（P＜0.01），說明 TAA 成功誘導(dǎo)大鼠急性肝性腦病。與模型組相比，DB中、高劑量組和陽性藥組均能明顯降低大鼠血氨水平（P＜0.01 或 P＜0.05）；低、中、高劑量組和陽性藥組均能明顯降低大鼠結(jié)腸內(nèi)容物pH值（P＜0.01）。結(jié)果表明DB能降低大鼠體內(nèi)氨的含量，具有改善肝性腦病作用。見表4。

表4 各組大鼠血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH值的比較（±s）Tab.4 Comparison of blood ammonia and pH of colon contents of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH值的比較（±s）Tab.4 Comparison of blood ammonia and pH of colon contents of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與 DB 低劑量組比較，△P＜0.05。

結(jié)腸內(nèi)容物pH對照組 - 102.0±25.40 6.76±0.19模型組 - 228.7±68.33** 7.40±0.31**陽性藥組 6×103 179.0±23.43# 6.75±0.24##DB 低劑量組 6.25 194.2±49.64 6.99±0.13##DB 中劑量組 25 145.5±25.56##△ 6.73±0.19##DB 高劑量組 100 156.5±25.73## 6.57±0.24##△組別 劑量（mg/kg）血氨值（μmol/L）

3.4 各組血清及肝生化指標測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP 水平均顯著升高（P＜0.01），說明 TAA 誘導(dǎo)的急性肝性腦病模型大鼠出現(xiàn)嚴重肝臟損傷。與模型組相比，陽性藥組可顯著降低 ALT、AST、TBiL 水平（P＜0.05 或P＜0.01）。DB 中、高劑量組顯著降低 ALT、AST、TBiL、ALP 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）；低劑量組可顯著降低 ALT、TBiL 水平（P＜0.01）。表明 DB 有較好的保護肝細胞、改善肝功能作用。與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著提高（P＜0.01 或 P＜0.05）。與模型組相比，DB 中、高劑量組能顯著降低 TNF-α 水平（P＜0.01）；DB 低、中、高劑量組均能顯著降低 IL-6 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）。結(jié)果說明DB可通過抑制促炎細胞因子的表達來發(fā)揮對肝性腦病的干預(yù)作用。見表5。

表5 各組大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP、TNF-α、IL-6濃度（±s）Tab.5 Concentrations of AST，ALT，TBiL，ALP，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP、TNF-α、IL-6濃度（±s）Tab.5 Concentrations of AST，ALT，TBiL，ALP，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對照組模型組陽性藥組DB低劑量組DB中劑量組DB高劑量組劑量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L） TBiL（μmol/L） ALP（U/L） TNF-α（pg/mL） IL-6（pg/mL）-26.33± 5.96 66.80± 31.24 0.17±0.03 132.00± 37.67 28.78±1.47 48.94±20.41- 1 065.00±142.20**1 161.00±353.30** 2.39±0.55** 488.00±136.10** 37.81±3.21** 85.66±21.84*6×103 814.30±163.80# 788.80±169.60## 1.17±0.43## 472.60± 54.92 36.76±3.07 51.47±26.51##6.25 685.10±210.60## 918.00± 65.02 1.43±0.60## 410.80± 81.69 34.54±6.28 56.30±23.61#25 658.60±196.20## 655.40±133.90## 1.37±0.15## 360.30± 59.02# 28.85±4.39## 49.63±12.08##100 740.00±193.00## 839.00±198.20# 1.47±0.33## 343.40± 51.92## 29.52±5.90## 52.06± 9.51#

3.5 大鼠肝組織病理變化 光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝織病理切片，結(jié)果見圖1。對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見肝細胞變性壞死，肝細胞排列整齊，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組大鼠肝細胞水樣變性明顯，可見明顯的肝細胞溶解、壞死，以小葉中心性壞死為主，橋接壞死多見，壞死區(qū)可見中重度炎細胞浸潤（混合細胞浸潤，以淋巴細胞為主），壞死及壞死后纖維組織增生明顯，發(fā)生纖維化，小葉結(jié)構(gòu)失常。與模型組相比，陽性藥組肝細胞壞死及炎細胞浸潤稍減輕。DB低、高劑量組水樣變性減輕，炎細胞浸潤減輕，壞死后肝纖維化為主；DB中劑量組炎細胞浸潤，壞死，肝纖維化較模型組減輕，壞死后纖維組織增生較明顯，小葉結(jié)構(gòu)尚正常。

圖1 DB對肝性腦病大鼠肝組織病理變化的影響（HE，×100）Fig.1 Effect of DB on pathological changes of liver tissue in hepatic encephalopathy rats(HE，×100)

3.6 對大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA和Glu濃度的影響 ELISA檢測結(jié)果見表6。與對照組相比，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，DB低、中、高劑量組和陽性藥組均能顯著降低 GABA 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）。與對照組相比，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)中Glu水平出現(xiàn)下降趨勢，各給藥組大鼠Glu水平較模型組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，DB 可以通過調(diào)節(jié)大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA及Glu的含量來發(fā)揮對肝性腦病的干預(yù)作用。

表6 各組大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA、Glu濃度（±s）Tab.6 Concentrations of GABA and Glu in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA、Glu濃度（±s）Tab.6 Concentrations of GABA and Glu in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Glu（ng/mL）對照組 - 267.90± 53.17 42.47±24.43模型組 - 652.90±205.60** 31.43± 8.04陽性藥組 6×103 403.60± 94.47## 35.17±17.32 DB 低劑量組 6.25 470.50±117.40# 38.64± 5.74 DB中劑量組 25 362.30±45.90## 41.46±7.04 DB高劑量組 100 454.40±97.50## 40.77±6.79組別 劑量（mg/kg）GABA（pg/mL）

3.7 對大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K、p-AKT蛋白表達的影響 為進一步探討DB的作用機制，利用Western blot技術(shù)對與肝性腦病相關(guān)的關(guān)鍵蛋白進行分析。與對照組相比，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K 和 p-AKT 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，DB低、中劑量組可顯著降低PI3K蛋白水平（P＜0.01 或 P＜0.05）；DB 中、高劑量組可顯著降低p-AKT 蛋白水平（P＜0.05或 P＜0.01）。說明 DB 可以通過調(diào)控前額葉皮質(zhì)中PI3K和p-AKT的蛋白表達來發(fā)揮對肝性腦病的干預(yù)作用。見圖2、表7。

表7 各組大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K、p-AKT蛋白表達情況（±s）Tab.7 The expression of PI3K and p-AKT proteins in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

表7 各組大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K、p-AKT蛋白表達情況（±s）Tab.7 The expression of PI3K and p-AKT proteins in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 劑量（mg/kg） PI3K/β-actin P-AKT/β-actin對照組 — 0.337±0.027 0.155±0.098模型組 — 0.890±0.135* 0.609±0.173*陽性藥組 6×103 0.144±0.098## 0.336±0.177 DB 低劑量組 6.25 0.233±0.254# 0.219±0.049 DB 中劑量組 25 0.181±0.099## 0.097±0.049##DB 高劑量組 100 0.442±0.373 0.143±0.140#

圖2 大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K、p-AKT蛋白表達情況Fig.2 Expression of PI3K and p-AKT in the prefrontal cortex of rats

4 討論

本實驗采用TAA誘導(dǎo)法建立急性肝性腦病大鼠模型，其機制為TAA被肝細胞內(nèi)細胞色素P450氧化酶代謝，產(chǎn)生有毒的TAA-硫氧化合物，進而引起脂質(zhì)過氧化、肝臟代謝紊亂等損傷，導(dǎo)致炎細胞浸潤、肝細胞壞死及肝纖維化等改變，最終引起急性肝功能衰竭誘發(fā)A型肝性腦病[16]。該模型的3個判斷標準為大鼠行為學(xué)，血氨值和肝功能指標的變化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)TAA造模后，模型組大鼠行為學(xué)、血氨、肝生化指標與對照組相比，均有顯著性改變，說明急性肝性腦病大鼠模型造模成功。

臨床上評價藥物治療肝性腦病的效果時，主要觀察指標為患者的認知功能、血氨水平和肝功能指標。本實驗選擇Morris水迷宮實驗，它是研究動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力常用的模型工具[18]，通過測定尋臺潛伏期來評價大鼠的空間學(xué)習(xí)能力、測定穿環(huán)指數(shù)來評價大鼠的空間記憶能力。結(jié)果顯示，TAA造模后，與空白組相比，模型組大鼠尋臺潛伏期出現(xiàn)顯著延長，穿環(huán)指數(shù)顯著減少；預(yù)防性給予DB治療后，中、高劑量組可顯著降低尋臺潛伏期，增加穿環(huán)指數(shù)，說明DB可以改善肝性腦病大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。此實驗選擇血氨和結(jié)腸內(nèi)容物pH值這兩個指標來反映肝性腦病大鼠體內(nèi)氨水平。結(jié)果顯示，DB中、高劑量組可顯著降低肝性腦病大鼠血氨水平，且低、中、高劑量組均可降低結(jié)腸內(nèi)容pH值，推測其發(fā)揮作用的方式可能為DB酸化腸道后，導(dǎo)致腸道內(nèi)細菌產(chǎn)氨減少，同時減少氨分子的吸收，促進血氨滲入腸道排出[19]。故DB可有效降低肝性腦病大鼠體內(nèi)氨含量。本研究選擇ALT、AST、ALP、TBiL作為肝功能檢測指標，其中ALT和AST是血清肝生物標志物，是早期急性肝損傷的主要生化指標[20]，ALP和TBiL在肝損傷或膽汁淤積時會出現(xiàn)升高[21]。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組上述肝功指標出現(xiàn)顯著升高，說明模型組大鼠肝損傷嚴重，DB中、高劑量組可顯著降低上述4個指標，說明其有較好的保護肝細胞、改善肝功能作用。此外，由于急性肝性腦病有死亡率高的特點[3]，故本研究考察了各組大鼠死亡情況，發(fā)現(xiàn)DB可以顯著降低急性肝性腦病大鼠的死亡率，其原因與改善上述提及的指標有關(guān)。

炎癥反應(yīng)在肝性腦病的病理過程中發(fā)揮著重要作用，當肝臟損傷后，體內(nèi)出現(xiàn)嚴重的炎癥反應(yīng)，大量的炎癥介質(zhì)與高血氨協(xié)同對大腦產(chǎn)生影響，其中TNF-α和IL-6能增加腦血管內(nèi)皮細胞的通透性、破壞血腦屏障功能，從而引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎癥反應(yīng)。此實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，DB中、高劑量組可顯著降低血清中TNF-α和IL-6水平，說明DB可通過減少促炎細胞因子的表達來發(fā)揮對肝性腦病的干預(yù)作用。

神經(jīng)遞質(zhì)異常在肝性腦病發(fā)病機制中的作用愈受關(guān)注，Jones[22]指出肝性腦病的發(fā)生是因為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如GABA和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸功能失衡[23]。肝性腦病發(fā)生時，GABA入腦增多，影響肝性腦病大鼠學(xué)習(xí)、記憶[24]。Glu，作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對突觸可塑性的維持、神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元回路的形成和學(xué)習(xí)過程起重要作用[25]。本實驗結(jié)果顯示，DB能顯著降低肝性腦病大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA含量，增加前額葉皮質(zhì)中谷氨酸水平，表明DB可以通過調(diào)節(jié)大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA和谷氨酸含量，起到改善肝性腦病的作用。

為進一步研究DB對急性肝性腦病大鼠的干預(yù)作用機制，結(jié)合文獻研究表明，黃芩素可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[26-27]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K和pAKT蛋白表達較對照組顯著上升，DB中劑量組可顯著降低PI3K和pAKT蛋白表達，說明DB可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，起到改善肝性腦病作用。

綜上所述，DB能夠改善TAA誘導(dǎo)的急性肝性腦病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和肝功能，降低體內(nèi)氨水平，抑制炎癥因子表達，調(diào)節(jié)前額葉皮質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)（GABA和谷氨酸）水平，其作用機制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號通路有關(guān)。