糖皮質激素對視神經脫髓鞘大鼠S1PR1、S1PR3表達及視覺功能的影響①

王 智 李 靜 王繼光 高 倩 魏 琰 （衡水市人民醫院神經內二科，衡水053000）

視神經脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）為脊髓和視神經相繼或同時損傷的一種中樞神經系統自身免疫性疾病，疾病早期多表現為視神經脫髓鞘等病變，患者多伴隨視力變差、意識障礙、眼球顫動等，嚴重可導致失明，若受損神經持續缺血變性可進展為多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS），威脅患者生命［1-2］。糖皮質激素具有免疫抑制和抵抗炎癥等功能，為臨床治療NMO等自身免疫性疾病的首選藥物，國內外研究發現，高劑量糖皮質激素沖擊療法可有效改善NMO患者臨床癥狀，但作用機制尚未闡明［3-4］。既往研究認為，NMO與機體免疫失調相關，但免疫失調如何導致神經病變尚未明確。近年研究發現，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）可結合其受體（S1P receptor，S1PR），激活的S1P-S1PR 信號系統在淋巴細胞轉運和維持血管完整性方面發揮重要作用，從而參與復雜炎癥過程調節［5］。另有研究發現，星形膠質細胞（astrocytes，AST）表面 S1PR1、S1PR3 與 S1P 結合是其激活的關鍵，而 NMO 發病與 AST 細胞激活密切相關［6-7］。本研究推測S1PR1、S1PR3 可能是NMO 所致視神經脫髓鞘的治療靶標，通過建立NMO視神經脫髓鞘大鼠模型，觀察糖皮質激素對NMO大鼠視神經脫髓鞘及視覺功能的改善作用，并分析其對視神經組織S1PR1、S1PR3 蛋白表達的影響，以初步探究其治療NMO的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡雄性健康SD 大鼠45 只，體重（220±5）g，許可證號：SCXK（粵）2018-0002，購自廣東省醫學實驗動物中心，常規飼養于我院動物房，實驗設計經我院動物倫理委員會批準，遵守動物保護3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/支）購自常州四藥制藥有限公司；S1PR1、S1PR3、β-actin、鈣結合適配器分子1（Iba-1）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、POU 4級同源框1（POU4F1，又稱Brn3a）、巨噬細胞標記物ED-1 兔源抗體（貨號：ab77076、ab108370、ab8227、ab178847、ab4674、ab273099、ab31630）、驢抗兔IgG Alexa Fluor?647 抗體（貨號：ab150075）、羊抗兔IgG Alexa Fluor?488 抗體、DAPI 溶液（貨號：ab150077、ab104139）購自美國Abcam 公司；Tunel細胞凋亡綠色熒光試劑盒（貨號：C1088）購自上海碧云天有限公司；透射電子顯微鏡（型號：109T）購自美國Carl Zeiss Microscopy 公司；熒光顯微鏡（型號：BX50）、光學顯微鏡（型號：BX63）購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 參照文獻［8-9］并稍加改動，采用視神經鞘內注射人NMO-IgG（1 μl，20 mg/μl）法制備NMO大鼠，即為視神經脫髓鞘大鼠，術后14 d瞳孔收縮度明顯降低表明模型制備成功。造模過程中3 只大鼠未觀察到瞳孔收縮度明顯改變，共造模成功42 只，隨機分為：NMO 組、糖皮質激素組，每組14 只，另取14 只健康大鼠作為對照組。造模成功后14 d，糖皮質激素組大鼠尾靜脈輸注0.5 g/ml甲潑尼龍溶液（生理鹽水溶解），0.1 m/lmin，60 min，1 次/d，對照組、NMO 組輸注等量生理鹽水，連續給藥3 d。

1.2.2 視動實驗及瞳孔反射實驗評估大鼠視覺功能 末次給藥后12 h，隨機取10 只大鼠，參考WANG 等［10］方法進行視動實驗，將大鼠放在四面各有1臺顯示器的平臺上，黑暗環境中進行測試，顯示器上顯示垂直正弦波光柵（100%對比度），空間頻率依次為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 周/度（cpd），恒定速度為12 度/s。紅外敏感相機監測頭部運動圖像，大鼠頭部無明顯跟蹤運動時的最高空間頻率即為大鼠視銳度值。瞳孔反射實驗參考FERNANDEZ 等［11］方法，將大鼠置于黑暗中，采用高強度光刺激瞳孔30 s，紅外敏感相機采集眼睛瞳孔圖像（30幀/s），瞳孔收縮度（%）=（刺激前瞳孔直徑-刺激后瞳孔直徑）/刺激前瞳孔直徑×100%。

1.2.3 大鼠視網膜及視神經組織樣本采集及HE染色觀察 1.2.2 結束后，100 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，各組隨機取11 只，于眼科顯微鏡下取眼球（保留較長視神經），分離視網膜和視神經，含4%甲醛的PBS固定，制備石蠟切片（5 μm），部分切片采用HE 試劑盒染色，選取較完整切片置于光學顯微鏡下觀察視網膜及視神經，剩余切片用于Tunel、免疫熒光及免疫組化實驗；-80℃保存備用的視神經用于提取RNA 和蛋白。各組剩余3 只大鼠取眼球（保留較長視神經）后，分離視神經，含2%戊二醛和4%甲醛的PBS 中固定，制備超薄切片（70 nm）用于電鏡觀察。

1.2.4 透射電鏡檢測大鼠視神經脫髓鞘情況 取1.2.3 中超薄切片，70%乙醇溶液（含2%乙酸鈾酯）和檸檬酸鉛溶液染色，銅網固定，透射電鏡下觀察。

1.2.5 Tunel 法檢測視網膜RGC 細胞凋亡情況 取1.2.3中視網膜石蠟切片，按照Tunel試劑盒說明書依次處理切片，采用Brn3a 標記凋亡視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC），DAPI 復染，熒光顯微鏡下觀察，計算凋亡RGC 細胞比例。其中Brn3a 陽性（紅色熒光）為RGC 細胞；Tunel 陽性（綠色）為凋亡細胞；DAPI 陽性（藍色）為細胞核，Merge中呈黃色為凋亡RGC 細胞，每組10 片視網膜，每片視網膜取5個視野計算平均值。

1.2.6 免疫熒光法觀察視神經中巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞 取1.2.3 中視神經石蠟切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復抗原，固定，含0.1%Triton X-100 PBS 溶液通透，2%山羊血清封閉，分別加入 Iba-1、GFAP 及 ED1 一抗 4℃ 孵育過夜，洗片，加入熒光標記二抗室溫避光孵育50 min，洗片，加入DAPI室溫避光孵育5 min，含抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照并用ImagePro Plus 分析熒光強度，ED1 陽性（綠色熒光）為巨噬細胞；Iba1 陽性（紅色）為小膠質細胞；GFAP 陽性（紅色）為AST 細胞，每組10根視神經，每根取5個視野計算平均值。

1.2.7 免疫組化法檢測視神經中S1PR1、S1PR3、IL-17 表達 取1.2.3 中視神經石蠟切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復抗原，過氧化氫封閉，加入S1PR1、S1PR3及IL-17一抗室溫孵育1.5 h，洗片，加入HRP 標記二抗室溫避光孵育30 min，洗片，加入DAB 混合液室溫避光孵育5 min，蘇木精復染，光學顯微鏡拍照。

1.2.8 RT-qPCR 和Western blot 法檢測視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA 和蛋白表達 取 1.2.3 中視神經冷凍樣品，液氮研磨，提取RNA 和蛋白。RNA 經反轉錄后作為RT-qPCR 反應模板，以β-actin 作為內參進行RT-qPCR 擴增反應，檢測S1PR1、S1PR3 mRNA 表達，引物序列見表1。各組蛋白樣品采用BCA 法測定濃度，分別取15 g 上樣，依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印記、5%牛奶封閉，加入一抗 S1PR1、S1PR3 和 β-actin 抗體 4℃ 孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，增強化學發光液顯影，TANON成像系統拍照并分析條帶灰度。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學分析 采用SPSS25.00 軟件進行統計學分析，計量數據采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖皮質激素對NMO大鼠視覺功能的影響 與對照組相比，NMO 組及糖皮質激素組大鼠視銳度、瞳孔收縮度降低（P＜0.05）；與NMO 組相比，糖皮質激素組大鼠視銳度、瞳孔收縮度增高（P＜0.05，表2）。

表2 3組大鼠視銳度、瞳孔收縮度比較（，n=10）Tab.2 Comparison of visual acuity and pupil contraction of rats in three groups（，n=10）

表2 3組大鼠視銳度、瞳孔收縮度比較（，n=10）Tab.2 Comparison of visual acuity and pupil contraction of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Pupil contraction（%）78.09±3.61 36.21±3.341）69.43±4.231）2）Groups Control NMO Glucocorticoid Visual acuity（cpd）0.57±0.06 0.17±0.051）0.34±0.021）2）

2.2 糖皮質激素對NMO大鼠視神經組織的影響 對照組大鼠視神經結構正常，軸索纖維及神經元均勻著色，排列整齊；NMO 組大鼠視神經可見神經元體積變大、排列混亂、核染色較深，軸索纖維中呈空泡及炎癥細胞浸潤病變；糖皮質激素組上述病變明顯緩解，形態接近對照組（圖1）。

圖1 大鼠視神經組織HE染色（×400）Fig.1 HE staining of optic nerve tissue in rats（×400）

2.3 糖皮質激素對NMO大鼠視神經脫髓鞘程度的影響 對照組大鼠視神經髓鞘結構正常，均可見黑色髓鞘；NMO 組大鼠大部分視神經可見軸突退化、脫髓鞘、板層小體等病變；糖皮質激素組脫髓鞘程度明顯減輕，形態接近對照組（圖2）。

圖2 大鼠視神經組織透射電鏡圖（×100 000）Fig.2 Transmission electron microscope of optic nerve tis?sue in rats（×100 000）

2.4 糖皮質激素對NMO大鼠視網膜形態及細胞凋亡的影響 對照組大鼠視網膜結構正常，凋亡RGC細胞較少；相較于對照組，NMO 組、糖皮質激素組大鼠視網膜厚度降低，RGC 細胞數減少，凋亡RGC 細胞比例增高（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質激素組視網膜厚度升高，RGC 細胞數增多，凋亡RGC 細胞比例降低（P＜0.05，圖3、表3）。

表3 大鼠視網膜厚度、RGC細胞數及凋亡RGC細胞比例比較（，n=10）Tab.3 Comparison of retinal thickness，number of RGC cells and proportion of apoptotic RGC cells of rats（，n=10）

表3 大鼠視網膜厚度、RGC細胞數及凋亡RGC細胞比例比較（，n=10）Tab.3 Comparison of retinal thickness，number of RGC cells and proportion of apoptotic RGC cells of rats（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Proportion of apoptotic RGC cells（%）3.05±0.95 37.50±3.341）19.35±1.961）2）Groups Control NMO Glucocorticoid Retinal thickness（μm）263.11±7.51 159.23±6.951）196.67±8.021）2）RGC cells number（individual）91.05±6.15 45.75±4.331）71.15±4.921）2）

圖3 大鼠視網膜HE染色及Tunel檢測（×400）Fig.3 HE staining and Tunel examination of rat retina（×400）

2.5 糖皮質激素對NMO 大鼠視神經巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞的影響 相較于對照組，NMO組、糖皮質激素組大鼠視神經巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質激素組視神經巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞減少（P＜0.05，圖4、表4）。

表4 3 組大鼠視神經中巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞比例比較（，n=10）Tab.4 Comparison of proportions of macrophages，mi?croglia and AST cells in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

表4 3 組大鼠視神經中巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞比例比較（，n=10）Tab.4 Comparison of proportions of macrophages，mi?croglia and AST cells in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Groups Control NMO Glucocorticoid ED1+region 0.00±0.00 12 752.42±296.481）Iba1+region 3 091.05±126.15 10 745.75±144.321）GFAP+region 9 823.05±150.72 19 643.50±183.391）5 194.67±108.021）2）5 671.15±114.811）2）11 079.35±1.751）2）

圖4 大鼠視神經組織免疫熒光圖（×400）Fig.4 Immunofluorescence of rat optic nerve tissue（×400）

2.6 糖皮質激素對NMO 大鼠視神經中S1PR1、S1PR3、IL-17表達的影響 相較于對照組，NMO 組、糖皮質激素組大鼠視神經中S1PR1、S1PR3、IL-17表達增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質激素組視神經中 S1PR1、S1PR3、IL-17 表達減少（P＜0.05，圖5）。

圖5 大鼠視神經組織免疫組化圖（×400）Fig.5 Immunohistochemistry of optic nerve tissue in rats（×400）

2.7 糖皮質激素對NMO 大鼠視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達的影響 相較于對照組，NMO 組、糖皮質激素組大鼠視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質激素組視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA及蛋白表達減少（P＜0.05，圖6、表5）。

表5 3 組大鼠視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA and protein expression levels of S1PR1，S1PR3 in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

表5 3 組大鼠視神經中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA and protein expression levels of S1PR1，S1PR3 in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Groups protein 0.35±0.11 1.46±0.281）1.01±0.161）2）S1PR1 mRNA 1.05±0.23 5.97±0.771）3.01±0.541）2）Control NMO Glucocorticoid protein 0.55±0.16 3.08±0.421）1.21±0.331）2）S1PR3 mRNA 0.96±0.34 4.71±0.591）2.78±0.371）2）

圖6 Western blot檢測大鼠視神經中S1PR1、S1PR3表達Fig.6 Western blot of S1PR1 and S1PR3 expressions in optic nerve of rats

3 討論

多數NMO 患者均檢測到血清自身抗體NMO 免疫球蛋白G（NMO-IgG）存在，為揭示NMO 發病機制提供了方向。由于NMO-IgG 與NMO 的相關性，NMO-IgG 被動轉移已被用于建立NMO 嚙齒動物模型［12-13］。大鼠視神經鞘內注射人NMO-IgG 建立的NMO 模型可直接反映視神經病變對視覺功能的影響，有利于評估藥物對視神經病變的治療作用［8-9］。本研究發現，相較于對照組，NMO 組大鼠視銳度、瞳孔收縮度降低，視神經現脫髓鞘、神經元體積變大、排列混亂、軸突退化、巨噬細胞、小膠質細胞和AST細胞增多等病變，視網膜厚度及RGC 細胞數減少，凋亡RGC 細胞比例增高，表明視神經注射NMO-IgG可成功誘導NMO 病變，引起視神經脫髓鞘、小膠質細胞/巨噬細胞活化、膠質增生、視覺功能變差，提示模型制備成功。隨著對NMO 發病機制研究的深入，對其治療藥物的研發也逐漸增多，對現有藥物治療機制的挖掘可能為尋找新藥物提供思路。臨床研究發現，高劑量（500 mg/d）糖皮質激素可加速急性期 MS 或 NMO 患者康復，減輕視神經炎癥［14］。本研究發現，輸注糖皮質激素后，大鼠視銳度、瞳孔收縮度均增高，視神經脫髓鞘、神經元體積變大、巨噬細胞、小膠質細胞和AST 細胞增多等病變減輕，視網膜厚度及RGC細胞數增加，凋亡RGC細胞比例降低，表明糖皮質激素可減輕視神經脫髓鞘程度，抑制小膠質細胞/巨噬細胞活化及膠質增生，改善NMO大鼠視覺功能。

S1P-S1PR 信號系統可啟動AST 細胞活化，與神經組織中炎癥密切相關，其中S1PR1、S1PR3 為S1PR 家族中與MS 等自身免疫病相關的2 種受體，除可通過激活AST 細胞活化、誘導膠質增生外，還可促進神經細胞中小膠質細胞/巨噬細胞活化，誘導IL-17 等炎癥介質釋放，加速神經損傷［15］。研究發現，S1P-S1PR 信號系統可引起腦組織等中樞神經系統反應性膠質增生，促進炎癥反應，與MS 等疾病相關［16-17］。研究報道，MS 與 AST 細胞 S1PR3 高表達有關，細胞實驗亦發現，上調S1PR3，激活S1P-S1PR信號系統可促進AST 細胞激活、膠質增生及炎癥反應［18-19］。由于 NMO 和 MS 具有廣泛相似的癥狀，且均為免疫介導的神經退行性疾病，可能具有潛在分子機制，本研究對此進行初步探究，結果與MS 一致，相較于對照組，NMO 組及糖皮質激素組大鼠視神經中 S1PR1、S1PR3 及 IL-17 蛋白表達均增高，表明NMO 所致視神經脫髓鞘大鼠視神經組織中S1P-S1PR 系統被激活，且下游IL-17 等炎癥因子水平升高。研究發現，小檗堿可通過降低S1P 水平抑制S1P 與S1PR 結合，降低炎癥水平，改善MS 小鼠神經功能缺失，減輕脫髓鞘等病變［20-21］。TSAI 等［22］進一步證實，S1PR1 在中樞神經系統自身免疫和神經炎癥中起重要作用。本研究發現，給予糖皮質激素治療后，大鼠視神經中 S1PR1、S1PR3 及 IL-17 蛋白表達降低，推測糖皮質激素對NMO所致視神經脫髓鞘大鼠視覺功能的改善作用可能與抑制S1PR1、S1PR3 表達，降低視神經炎癥水平有關，S1PR1、S1PR3 表達降低可阻斷S1P-S1PR 信號系統，進而抑制視神經中AST 細胞及小膠質細胞/巨噬細胞激活，減輕視神經炎癥，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，高劑量糖皮質激素可降低視神經中S1PR1、S1PR3 蛋白表達，抑制 IL-17 等釋放，降低視神經中炎癥細胞比例，改善NMO所致視神經脫髓鞘大鼠視覺功能，可能為尋找治療NMO的新藥物提供參考。另外，高劑量糖皮質激素可能引起心動過速、代謝紊亂、電解質失調等副作用，治療時應密切關注患者生命體征，以確保治療效果。