硫化氫對過氧化氫損傷的內皮細胞eNOS和NO表達的影響①

張海波 焦 潔 李平平 宋志明 （河南大學第一附屬醫院，開封 475001）

冠狀動脈硬化性心臟病（冠心病）是威脅人類健康的主要疾病。尤其隨著人口老齡化及城鎮化進程的加速，心血管病危險因素明顯增多，導致冠心病的發病人數持續增加。據最新發布的《中國心血管健康與疾病報告2019》顯示，推算心血管病現患人數約3.3 億，其中冠心病患者1 100 萬，給患者家庭、社會以及國家社保帶來了巨大的經濟負擔［1］。內皮功能障礙為心血管疾病的始動環節，早于動脈粥樣硬化形態學改變［2］。因此，尋找到針對內皮細胞損傷的干預措施將成為治療動脈粥樣硬化相關性疾病的關鍵點。

既往研究證實一氧化氮（NO）系統參與了內皮細胞損傷的發病，而本課題組前期研究發現硫化氫（H2S）對高糖誘導的內皮細胞損傷具有保護作用［3］。本研究旨在觀察外源性H2S對H2O2誘導的內皮細胞損傷的保護作用及其對NO系統的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 H2O2、MTT 和 NaHS（161527）購自 Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen；無血清培養基（SFM）、M199 培養基和胎牛血清（FBS）購自Gibco；內皮細胞生長因子（ECGS）購自 BD 公司；抗eNOS 抗體（9586）購自Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體（10494-1-AP）購自Proteintech；小鼠Ⅱ抗（BM3895）及兔Ⅱ抗（BM3894）購自武漢博士德；細胞裂解液和蛋白定量試劑盒（BCA）購自南京凱基；預染蛋白 marker 購自 Fermentas；NO 測試試劑盒購自南京建成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 本研究采用原代人臍靜脈內皮細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），其分離培養依據既往報道進行［3］。研究所用細胞為1~3代。本研究經河南大學第一附屬醫院倫理委員會討論并批準，符合Helsinki原則。

1.2.2 流式細胞檢測 收取第1代內皮細胞，交由河南大學第一附屬醫院實驗室檢測細胞表面標志物CD31。

1.2.3 內皮細胞損傷模型的建立 取對數生長的細胞按1×104個/孔分別接種于6 孔培養板中，待細胞生長至60%~70%時，換用含不同濃度H2O（20、20、40、80、160 μmo/lL）的培養基，繼續培養24 h 后分別進行細胞形態和活力檢測。

1.2.4 H2S 對H2O2損傷細胞的干預 取對數生長的細胞按1×104個/孔分別接種于6 孔培養板中，待細胞生長至60%~70%時，換用含2%胎牛血清的DMEM 培養基饑餓細胞8 h，加入含不同濃度NaHS（0、50、100、200、500 μmo/lL）的DMEM 培養基作用1 h，添加80 μmo/lL H2O2繼續培養24 h。

1.2.5 細胞活力的測定 內皮細胞接種于96孔板中，4 000 個/孔，24 h 后根據實驗需要進行不同處理，每個處理因素設5個復孔。處理結束后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT 培養4 h；去除培養基后，每孔加入150 μl DMSO，用錫箔紙遮蓋后置于搖床上15 min 充分搖勻。最后在490 nm 處，用酶標儀讀取各孔的吸光度值（A490）。

1.2.6 免疫蛋白印跡

1.2.6.1 蛋白提取和定量 細胞經過處理后，按照試劑盒說明進行蛋白的提取，大致過程如下：每孔加50 μl 細胞裂解液，冰上孵育10～20 min，細胞裂解液移入1.5 ml EP 管，13 200/rmin 4℃ 離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80℃冰箱備用。具體定量過程詳見南京凱基說明書（BCA法）。

1.2.6.2 Western blot 經BCA 定量，取等量蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗體，4℃過夜孵育；棄去Ⅰ抗，TBST 洗3 次，加入小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST 洗 3 次 ECL 曝光；Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

1.2.7 NO 含量測定 采用試劑盒測定細胞培養液中NO含量，操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，定量資料用表示，均數比較采用方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HUVECs 鑒定 采用流式細胞儀檢測，第1 代內皮細胞CD31 抗原陽性率99.9%，符合內皮細胞特性（圖1）。

圖1 流式細胞術檢測細胞表面CD31Fig.1 Detection of CD31 on surfaces of cells by flow cy?tometry

2.2 H2O2損傷模型的建立 內皮細胞生長至60%~70%時，加入不同濃度的H2O2培養基，結果發現含20、40、80、160 μmol/L H2O2培養基加入后細胞生長緩慢，且隨濃度增加，貼壁細胞數明顯減少（圖 2）。MTT 結果提示 80 和 160 μmol/L H2O2處理組細胞活力分別減低至（49.7±11.5）%和（18.9±9.4）%，較正常對照組差異有統計學意義（圖3）。以80 μmol/L H2O2作用24 h對總體細胞數影響較小且能有效誘導細胞損傷，故作為損傷模型濃度繼續應用。

圖2 不同濃度H2O2處理后HUVECs細胞形態（×100）Fig.2 Representative cell morphology of HUVECs after treatment with various concentrations of H2O2（×100）

圖3 不同濃度H2O2處理對HUVECs細胞活力的影響Fig.3 Cell viability of HUVECs treated with various con?centrations of H2O2

2.3 不同濃度NaHS 對細胞活力的影響 內皮細胞接種于 96 孔板，生長 24 h 后，分別給予 50、100、200、500 μmo/lL NaHS，繼續培養 24 h 后對細胞進行 MTT 活性檢測。500 μmo/lL NaHS 組細胞活力為（80.3±4.6）%，與對照組存在統計學差異。而其他濃度對內皮細胞的生長均無明顯影響（圖4）。為避免NaHS 自身損傷作用，后續實驗選用50、100、200 μmo/lL 3個濃度對細胞進行干預。

圖4 不同濃度NaHS處理對HUVECs細胞活力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaHS on cell viability

2.4 NaHS 對H2O2損傷細胞活力的影響 內皮細胞接種于 96 孔板，生長 24 h 后，分別給予 50、100、200 μmo/lL NaHS，共同孵育1 h 后，加入80 μmo/lL H2O2，培養 24 h。100 μmo/lL 和 200 μmo/lL NaHS組內皮細胞活力分別為（77.3±8.2）%和（70.6±7.4）%，與H2O2組比較差異均有統計學意義（圖5）。

圖5 NaHS對H2O2損傷HUVECs細胞活力的影響Fig.5 Effect of NaHS on cell viability in H2O2-injured HU?VECs

綜合以上NaHS 對內皮細胞活力的影響結果，100 μmo/lL NaHS 為研究外源性H2S 對內皮細胞損傷作用的最優濃度。后續研究將以100 μmo/lL NaHS探討其對內皮損傷的保護作用。

2.5 NaHS 對H2O2損傷的內皮細胞NO 系統的影響 通過Western blot 檢測蛋白發現，與對照組相比，H2O2組細胞eNOS 蛋白的表達水平和NO 的濃度均明顯降低。與H2O2組相比，NaHS 組細胞eNOS 蛋白的表達和NO的濃度均明顯升高（圖6）。

圖6 NaHS 對 H2O2 損傷 HUVECs 細胞內 eNOS 表達及 NO濃度的影響Fig.6 Effect of NaHS on eNOS expression and NO con?centration in HUVECs injured by H2O2

3 討論

本課題研究發現，80 μmol/L H2O2能夠誘導原代人內皮細胞損傷模型；NaHS 部分拮抗H2O2對NO系統的影響，改善內皮細胞損傷。

內皮細胞損傷模型是闡明內皮損傷機制的重要工具［4］。目前，用于損傷模型制備的內皮細胞類型有原代培養的內皮細胞和內皮細胞株。原代內皮細胞，需分離培養且傳代次數有限。內皮細胞株大多為商品化的腫瘤細胞株，如EA. hy926 和HUVEC-12。引起內皮細胞損傷的因素有多種，如H2O2、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）和細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［5-7］。應用原代細胞誘導的疾病模型無論從臨床上還是生理上都更接近人類疾病，鑒于此本研究選擇了原代人臍靜脈內皮細胞作為研究對象。同時H2O2來源方便、價格低廉、損傷效果明顯，其誘導的內皮細胞損傷模型為目前廣泛應用的研究內皮損傷的工具藥物［4］。H2O2在過氧化條件下可分解成氧自由基，通過對生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化反應引起細胞損傷，是內皮細胞損傷的理想模型［8］。綜合以上因素，本研究選用了H2O2誘導的原代HUVECs損傷模型。

H2S 是繼 CO 和 NO 之后在人體內發現的第 3 種內源性氣體信號分子，在心血管系統穩態中發揮重要作用［9］。在哺乳動物細胞中，H2S由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的作用下合成，而在血管系統中其合成主要受CSE 調控。在高血壓患者中，CSE 的表達及其合成H2S 的活性明顯減低，導致了微血管內皮功能障礙［10］。XIAO 等［11］研究者發現給予 20 周 NaHS 處理能夠明顯改善高血壓大鼠的內皮功能。此外，有研究提示H2S 通過增加 NO 生物利用度改善內皮細胞功能［12］。在本研究中，H2S 增強了H2O2損傷的內皮細胞的活力，增加了eNOS 蛋白表達，并最終增加了NO 的合成。本研究結果與既往研究結果保持一致。

本研究結果提示，H2S 改善H2O2誘導的內皮細胞損傷，這可能與其增加eNOS 表達和NO 合成有關。后續的研究將進一步闡述H2S 對于eNOS/NO具體的調控機制，以豐富和深化H2S 在內皮細胞功能乃至心血管系統中的作用和靶點。