lncRNA CASC7 靶向下調miR-181a-2-3p 表達影響非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲①

蒙 沖 謝 甜 陳永倖 （海南省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，海口570100）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的類型之一，占肺癌患者80%以上［1］。NSCLC 早期診斷率低，多數患者確診時已處于中晚期，預后不佳［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）是兩類與人類多種疾病尤其是腫瘤的發生發展密切相關的小分子非編碼RNA，且兩者可相互作用［3-5］。癌易感性候選基因7（CASC7）長度為9.3 kb，屬于lncRNA。研究顯示，CASC7 在直腸癌組織和細胞系中表達降低，其過表達通過靶向抑制miR-21 降低結腸癌細胞的增殖和遷移［6］。但目前，CASC7 對 NSCLC 發生發展的影響機制還未知。DIANA-LncBase v2 在線預測軟件顯示，CASC7與miR-181a-2-3p的核苷酸序列存在連續結合位點，提示兩者之間可能存在相互作用。研究顯示，miR-181a-2-3p 在甲狀腺乳頭狀癌中表達上調，參與該疾病的發生發展［7］。但目前，miR-181a-2-3p 在NSCLC 組織中的表達及其對NSCLC 細胞惡性生物學行為的影響也還未知。本研究首先檢測了39 例NSCLC 患者組織和對應的癌旁組織中CASC7與 miR-181a-2-3p 的表達，并以 NSCLC 細胞 A549 為研究對象，觀察了CASC7 對A549 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其能否靶向調控miR-181a-2-3p發揮作用，以期為NSCLC 的分子治療提供可能的靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集2017 年10 月至2018 年12 月于本院行手術切除的39 例NSCLC 患者的癌組織和對應的癌旁組織，并在液氮中保存。其中39例患者中男性患者23 例，女性患者16 例，平均年齡（64.29±8.76）歲。TNM 分期Ⅰ期 6 例，Ⅱ期 12 例，Ⅲ期21例；淋巴結發生轉移24例，未轉移15例。納入標準：經病理診斷確診；手術前未進行放療、化療等治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝、腎等重要臟器功能障礙者；合并自身免疫系統疾病患者。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者知情同意。

1.1.2 實驗細胞和試劑 NSCLC 細胞A549 購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS）購自美國Hycolne 公司；RPMI1640 培養基、四甲基噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Trizol試劑購自美國 Invitrogen 公司；PCR 引物、CASC7 過表達載體（pcDNA-CASC7）、miR-181a-2-3p 模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-181a-2-3p）及各自的對照序列pcDNA、miR-NC 和 anti-miR-NC 均購自廣州銳博生物科技有限公司；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）、基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測CASC7和 miR-181a-2-3p 的 mRNA 表達 Trizol 試劑提取組織中總RNA，反轉錄為cDNA，行PCR 擴增。擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 個循環。引物序列見表1。CASC7 以GAPDH 為內 參 ，miR-181a-2-3p 以 U6 為 內 參 ，2-ΔΔCt法 計 算CASC7和miR-181a-2-3p水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細胞培養和轉染 復蘇A549 細胞，加含10% FBS 的RPMI1640 培養基培養。以1×105個/孔將A549 細胞接種于6 孔板，采用LipofectamineTM2000 脂質體法，分別轉染 pcDNA-CASC7（pcDNACASC7 組）、pcDNA（pcDNA 組）、pcDNA-CASC7 與anti-miR-NC（pcDNA-CASC7 與 anti-miR-NC 組）、pc-DNA-CASC7 與 anti-miR-181a-2-3p（pcDNA-CASC7+anti-miR-181a-2-3p 組）。轉染 6 h 后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞備用。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗 PCR 擴增含miR-181a-2-3p結合位點的CASC7的3'UTR 序列，分別構建CASC7野生型質粒（CASC7-WT）和突變型質粒（CASC7-MUT）。將 CASC7-WT、CASC7-MUT 與miR-181a-2-3p mimic、miR-NC 共轉染至 A549 細胞。轉染6 h 后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞檢測熒光素酶活性。

1.2.4 MTT 實驗 以0.5×104個/孔將各組細胞接種于96 孔板，并以未轉染的A549 細胞作為對照組，每組設3個復孔。培養24 h，加20 μl的MTT（5 g/L）。然后孵育4 h，棄培養基，加150 μl 二甲基亞砜。振蕩混勻，于MB-530型多功能酶標儀490 nm處測光密度（OD）值。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell 實驗 調整各組細胞密度為5×104個/ml。遷移實驗：Transwell 上室加 100 μl 細胞懸液，下室加500 μl 培養基。培養24 h，棄培養基，經4%多聚甲醛固定、0.4%結晶紫染色后，顯微鏡觀察并拍照，對穿膜細胞進行計數。侵襲實驗：Matrigel 基質膠4℃ 融化，鋪于Transwell 上室，自然晾干后再加100 μl 細胞懸液，后續實驗步驟同遷移實驗。

1.2.6 細胞凋亡檢測實驗 以1×104個/孔將各組細胞接種于24 孔板。培養24 h，收集細胞。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書，采用CytoFLEX型流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡數+晚期凋亡數）/細胞總數×100%。

1.2.7 Western blot 實驗 以1×104個/孔將各組細胞接種于24 孔板。培養24 h，收集細胞。RIPA 試劑提取總蛋白，BCA 法對蛋白定量。然后進行10%SDS-PAGE 電泳。電泳后，濕轉至PVDF 膜。接著置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，再分別加入CyclinD1（1∶1 000）、cleaved-caspase-3（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 500）和MMP-9（1∶1 500）一抗，4℃ 孵育過夜。加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。加化學發光試劑，避光顯影，CSL-MDOCUV 1D 型凝膠成像系統曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析 SPSS22.0 軟件分析實驗數據。符合正態分布的計量資料以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。Pearson 相關性分析NSCLC 患者癌組織中CASC7 和miR-181a-2-3p 表達的相關性。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CASC7 和 miR-181a-2-3p 在 NSCLC 患者癌組織中的表達 與癌旁組織比較，NSCLC 患者癌組織中 CASC7 表達水平降低（P＜0.05），miR-181a-2-3p水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 CASC7 和miR-181a-2-3p 在NSCLC 患者癌組織中的表達水平（，n=39）Tab.2 Expression levels of CASC7 and miR-181a-2-3p in cancer tissues of NSCLC patients（，n=39）

表2 CASC7 和miR-181a-2-3p 在NSCLC 患者癌組織中的表達水平（，n=39）Tab.2 Expression levels of CASC7 and miR-181a-2-3p in cancer tissues of NSCLC patients（，n=39）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.04±0.08 2.59±0.111）71.167＜0.001 Groups Adjacent tissues Cancer tissues t P CASC7 1.01±0.09 0.31±0.061）40.415＜0.001

2.2 NSCLC患者癌組織中CASC7和miR-181a-2-3p表達的相關性 Pearson 相關性分析結果顯示，NSCLC 患者癌組織中 CASC7 與 miR-181a-2-3p 的表達呈負相關（r=-0.694，P＜0.001）。見圖1。

圖1 NSCLC 患者癌組織中CASC7 與miR-181a-2-3p 表達的相關性Fig.1 Correlation between CASC7 and miR-181a-2-3p expression in cancer tissues of NSCLC patients

2.3 CASC7 靶向負調控 miR-181a-2-3p CASC7 與miR-181a-2-3p 的核苷酸的結合位點見圖2。miR-181a-2-3p 可降低 CASC7-WT 的熒光素酶活性（P＜0.05），而對CASC7-MUT 的熒光素酶無顯著影響（P＞0.05），表明 CASC7 可與 miR-181a-2-3p 靶向結合，見表 3。與 pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞中CASC7表達水平升高，miR-181a-2-3p表達水平降低，進一步說明CASC7 負調控miR-181a-2-3p，見表4。

表3 雙熒光素酶報告基因實驗結果（，n=9）Tab.3 Experimental results of dual luciferase reporter genes（，n=9）

表3 雙熒光素酶報告基因實驗結果（，n=9）Tab.3 Experimental results of dual luciferase reporter genes（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

CASC7-MUT 1.02±0.05 0.99±0.03 1.543＜0.001 Groups miR-NC miR-181a-2-3p t P CASC7-WT 1.03±0.06 0.37±0.051）25.351＜0.001

表4 過表達 CASC7 對 miR-181a-2-3p 表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of overexpressing CASC7 on expression of miR-181a-2-3p（，n=9）

表4 過表達 CASC7 對 miR-181a-2-3p 表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of overexpressing CASC7 on expression of miR-181a-2-3p（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.05±0.03 0.25±0.021）66.564＜0.001 pcDNA pcDNA-CASC7 t P 1.03±0.05 2.90±0.141）37.737＜0.001 GroupsCASC7

圖2 CASC7與miR-181a-2-3p的核苷酸序列的結合位點Fig.2 Binding site of CASC7 and miR-181a-2-3p nucleo?tide sequence

2.4 CASC7負調控miR-181a-2-3p對細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞OD 值降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與pcDNA-CASC7+miR-NC 組 比 較 ，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 組細胞OD 值升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）。對照組與pcDNA 組比較及pcDNACASC7 組與pcDNA-CASC7+miR-NC 組比較細胞OD值和凋亡差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和表5。

表5 各組細胞OD值和凋亡率（，n=9）Tab.5 OD value and apoptosis rate of each group of cells（，n=9）

表5 各組細胞OD值和凋亡率（，n=9）Tab.5 OD value and apoptosis rate of each group of cells（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups OD490 nm Apoptosis rate（%）2.42±0.32 2.60±0.41 29.15±3.771）27.85±3.39 6.04±0.742）317.275＜0.001 Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P 0.61±0.05 0.63±0.06 0.35±0.051）0.32±0.03 0.56±0.042）88.500＜0.001

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry detection of apoptosis in each group

2.5 CASC7負調控miR-181a-2-3p對細胞遷移和侵襲的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞 遷 移 和 侵 襲 數 降 低（P＜0.05）。 與 pcDNACASC7+miR-NC 組比較，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 組細胞遷移和侵襲數升高（P＜0.05）。對照組與pcDNA 組比較及pcDNA-CASC7 組與pcDNACASC7+miR-NC組比較細胞遷移和侵襲數差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4和表6。

表6 各組細胞遷移和侵襲數（，n=9）Tab.6 Number of cell migration and invasion in each group（，n=9）

表6 各組細胞遷移和侵襲數（，n=9）Tab.6 Number of cell migration and invasion in each group（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Number of invasion cells 84.89±6.69 84.44±5.79 36.56±2.911）34.33±2.67 78.44±3.242）290.545＜0.001 Groups Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P Number of migrating cells 110.78±7.57 113.44±6.11 58.44±5.041）58.11±4.15 97.67±6.222）193.501＜0.001

圖4 Transwell檢測各組細胞遷移和侵襲（×200）Fig.4 Transwell detects cell migration and invasion in each group（×200）

2.6 CASC7 負調控 miR-181a-2-3p 對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞中 CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05），cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05）。與pcDNA-CASC7+miRNC 組比較，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p組細胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高（P＜0.05），cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05）。對照組與 pcDNA 組及 pcDNA-CASC7 組與 pcDNA-CASC7+miR-NC 組比較細胞中CyclinD1、cleaved-caspases-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞中 CyclinD1、cleaved-caspase-3、MMP-2 和MMP-9蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of CyclinD1，cleaved-cas?pase-3，MMP-2 and MMP-9 in each group of cells

3 討論

作為近年來新發現的一種lncRNA，CASC7在多種腫瘤的發生發展中起重要作用。研究顯示，CASC7 低表達的神經膠質瘤患者預后不良，過表達CASC7 可抑制Wnt/β-catenin 信號通路降低神經膠質瘤細胞增殖能力并誘導細胞凋亡［8］；上調CASC7可靶向下調miR-10a抑制神經母細胞瘤細胞增殖［9］。但目前，CASC7 對NSCLC 發生發展的影響機制還未知。

本研究顯示，NSCLC 癌組織中CASC7 的表達明顯低于癌旁組織，過表達CASC7 抑制了A549 細胞增殖、遷移和侵襲，且誘導了A549 細胞凋亡，說明CASC7 在NSCLC 的發生和發展中也發揮抑癌基因作用，可作為NSCLC 治療的分子靶點。CyclinD1 參與調控細胞周期，其表達增加促進細胞增殖。Caspase家族是一組天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡途徑中起核心作用［10-11］。caspase-3是Caspase家族的關鍵調控分子，其活化后可直接切割細胞內蛋白底物，誘導細胞凋亡［12］。MMP-2 和MMP-9 可降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［13-14］。本研究顯示，過表達CASC7 降低了A549細胞中 CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達，而促進了化的caspase-3 蛋白表達，與相關報道結果一致，進一步表明過表達CASC7 抑制了A549 細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡［15-16］。

生物信息學在線軟件預測顯示，CASC7 可能靶向結合miR-181a-2-3p。本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了CASC7 可與miR-181a-2-3p 靶向結合，且過表達CASC7 抑制了A549 細胞中miR-181a-2-3p的表達，進一步說明了CASC7靶向負調空miR-181a-2-3p 表達，這與 NSCLC 組織中 CASC7 與miR-181a-2-3p 的表達呈負相關一致。有報道稱，甲狀腺癌中miR-181a-2-3p 的表達升高，且miR-181a-2-3p高表達的患者預后不佳［17］。本研究還顯示，下調miR-181a-2-3p 表達逆轉了過表達 CASC7 對 A549 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，提示過表達CASC7 通過靶向負調控miR-181a-2-3p來抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲及誘導細胞凋亡。

綜上所述，NSCLC 組織中CASC7 表達降低，而miR-181a-2-3p 表達升高，兩者呈負相關；過表達CASC7 可靶向負調控miR-181a-2-3p 有效降低NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進細胞凋亡，CASC7/miR-181a-2-3p 軸可能為 NSCLC 的靶向分子治療提供了新靶點。本研究尚存在不足之處，接下來將進一步探究miR-181a-2-3p的下游靶基因和信號通路在NSCLC 發生發展中的作用及通過動物實驗在體內驗證CASC7/miR-181a-2-3p 軸對NSCLC發生發展的影響。