氧化苦參堿經(jīng)Bcl-6/CXCR5信號(hào)調(diào)控CIA小鼠Tfh-B細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究①

崔振華 王佩佩 詹靜慧 擺 茹 張艷麗

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，銀川750004）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的自身免疫性疾病，其特征是關(guān)節(jié)炎癥、骨破壞、疼痛，導(dǎo)致進(jìn)行性殘疾、全身并發(fā)癥和高社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本，其病因尚不明晰［1］。目前臨床用藥副作用明顯，為利用祖國(guó)中藥的優(yōu)勢(shì)，已有大量研究進(jìn)行了中藥干預(yù)試驗(yàn)，如木酚素、姜黃素等，但這些中藥的具體免疫學(xué)機(jī)制尚不明確［2-3］。

氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）是從苦參中提取的一種奎嗪生物堿，具有多種治療作用，如器官和組織保護(hù)、抗炎、抗癌和抗病毒作用［4］。OMT對(duì)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響也很明顯。OMT 可減少CCL4 誘導(dǎo)的肝纖維化疾病模型中CD68 巨噬細(xì)胞，DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中Th1 和Th17 細(xì)胞的數(shù)量，還能減少腦神經(jīng)炎、糖尿病模型中IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的分泌［5-9］。

在RA 中，B 細(xì)胞通過產(chǎn)生自身反應(yīng)性抗體，如抗瓜氨酸肽抗體（anti-citrullinated peptide antibodies，ACPA）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）發(fā)揮至關(guān)重要的作用。濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cell，Tfh）是的一種特殊的CD4+T 細(xì)胞，分泌IL-21、表達(dá)高水平CXC-趨化因子受體5（C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5）、誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子（inducible costimulator，ICOS）、轉(zhuǎn)錄因子B 細(xì)胞淋巴瘤因子6（B-cell lymphoma-6，Bcl-6）和各種免疫調(diào)節(jié)分子。Tfh 細(xì)胞在淋巴細(xì)胞濾泡生發(fā)中心的形成中起重要作用，促進(jìn)B 細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞或漿細(xì)胞，產(chǎn)生高親和力抗體，維持體液免疫反應(yīng)。T-B 細(xì)胞的合作和局部產(chǎn)生特定自身抗體是建立自身免疫性疾病所必需的。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者外周血中Tfh細(xì)胞的比例升高，血清中ACPA、RF、IL-21含量升高［10］。

因此，本研究通過觀察OMT 對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠炎癥反應(yīng)及Tfh、B 細(xì)胞的比例影響，分析其潛在機(jī)制，為RA 疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 DBA/1J 小鼠，雄性，6~8 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫25℃，模擬晝夜，自由飲水飲食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 氧化苦參堿購(gòu)自寧夏都順生物科技股份有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液購(gòu)自上海全宇生物科技（駐馬店）動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購(gòu)自Chondrex 公司；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液、4%組織細(xì)胞固定液、福爾馬林-EDTA 脫鈣液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Anti-mouse CD4 FITC、Antimouse CD278 PE、Anti-mouse GL7 PE 購(gòu)自 Invitrogen公司；Anti-mouse CD185 APC 購(gòu)自 eBioscience 公司；Anti-mouse B220 AF647 購(gòu)自美國(guó) BD 公司；抗小鼠Bcl-6 抗體購(gòu)于 Immunoway 公司；抗小鼠 CXCR5 抗體購(gòu)于SAB公司；HRP-羊抗兔二抗購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；Bcl-6、Blimp1、GAPDH 引物由上海生工生物有限公司合成；Mouse-IL-21 ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；Mouse-CII-Ab、Mouse-IL-10、Mouse-TGF-β ELISA 試劑盒購(gòu)自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；CELESTA流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及藥物干預(yù) 將28 只雄性DBA/1J 小鼠隨機(jī)分為2 組：正常對(duì)照組和CIA 組；CIA 組再分別設(shè)置為模型組、地塞米松組（DXMS）、氧化苦參堿（OMT）組；共4組，每組7只。

初次免疫，牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等體積混合成乳化狀態(tài)，呈油包水狀，全程在冰上操作。在CIA 組小鼠尾根部1~2 cm 處及背部進(jìn)行多點(diǎn)注射（100 μl）。初次免疫后第21 天，使用牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑等體積混合的乳化物，同等劑量，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

初次免疫后的第15 天，腹腔注射氧化苦參堿［根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11］選用高劑量180 mg/（kg·d）］，1次/d，每次100 μl；地塞米松組2.8 mg/kg注射7 d，后降至 1.4 mg/kg，1 次/d，每次 100 μl，至第 45 天結(jié)束。

1.2.2 模型構(gòu)建評(píng)估 觀察小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，從肉眼觀小鼠關(guān)節(jié)腫脹起，使用數(shù)顯測(cè)厚，由專人測(cè)量足腕關(guān)節(jié)處的踝腫脹度以及爪腫脹度，3 d一測(cè)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。關(guān)節(jié)腫脹程度（mm2）=右后爪腫脹（mm）×右后踝腫脹（mm）。

根據(jù)關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：按0~4 分五級(jí)評(píng)分，0 分，無紅腫；1 分，小趾關(guān)節(jié)稍腫；2 分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，記錄其累積分?jǐn)?shù)，每只小鼠的最高分?jǐn)?shù)為16分［12］。

1.2.3 觀察小鼠關(guān)節(jié)病理變化 取小鼠右后爪踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定48 h。后將關(guān)節(jié)放至EDTA脫鈣液，每周更換1 次，直至關(guān)節(jié)變軟。進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.4 觀察關(guān)節(jié)滑膜組織中Bcl-6、CXCR5 的表達(dá) 取小鼠右后爪踝關(guān)節(jié)，常規(guī)包埋制片，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)滑膜組織中Bcl-6（1∶500）、CXCR5（1∶500）的表達(dá)水平。

1.2.5 脾指數(shù)測(cè)定 取小鼠脾臟，剝離筋膜去除脂肪，進(jìn)行稱重。脾指數(shù)（mg/g）=脾濕重（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.6 ELISA 測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠眼球血，靜置離心，分離血清。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，顯色后，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm 吸光度下檢測(cè)抗Ⅱ型膠原IgG 抗體（CⅡ-Ab）、IL-21、IL-10、TGF-β 的 OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Tfh、B 細(xì)胞比例變化 取小鼠脾臟，研磨，加于淋巴細(xì)胞分離液上，保持液面分界清晰。離心800 g 30 min，得到單個(gè)核細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，稀釋，保持100 μl 細(xì)胞懸液中有1×106個(gè)細(xì)胞左右。設(shè)為8 管：空白對(duì)照管、FITC 標(biāo)記的 CD4 單染管、APC 標(biāo)記的 CXCR5 單染管、PE 標(biāo)記的 ICOS 單染管、CD4+XCR5+COS+三染管、FITC 標(biāo)記的 GL-7 單染管、AF647 標(biāo)記的 B220 單染管、GL-7+B220+雙染管。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采用FlowJo10進(jìn)行分析。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)脾臟Bcl-6、Blimp-1的表達(dá) 取小鼠脾臟，得到單個(gè)核細(xì)胞懸液，提總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) Bcl-6、Blimp-1 的轉(zhuǎn)錄水平（按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt計(jì)算。使用以下引物序列：GAPDH上游引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游引物：5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'；Bcl-6 上游引物：5'-AACCATACAAATGTGATCGCTG-3'，下游引物：5'-CACAAATGTTACAGCGATAGGG-3'；Blimp-1上游引物：5'-TGTGTGGTATTGTCGGGACTTTGC-3'，下游引物：5'-TTGCTTTGGGTTGCTTTCCGTTTG-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。同一個(gè)指標(biāo)兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的數(shù)值數(shù)據(jù)都代表至少3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并以表示。

2 結(jié)果

2.1 OMT 可緩解CIA 小鼠的關(guān)節(jié)炎癥 對(duì)關(guān)節(jié)足爪腫脹度及關(guān)節(jié)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖1 所示，CIA 小鼠在膠原誘導(dǎo)后出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)腫脹度以及關(guān)節(jié)評(píng)分在免疫后第37 天達(dá)到峰值（圖1B）。然而，與模型組相比，OMT 和DXMS 治療顯著降低了關(guān)節(jié)炎評(píng)分（圖1C）。

圖1 OMT對(duì)CIA小鼠的影響Fig.1 Effect of OMT on CIA mice

2.2 OMT 改善CIA 小鼠的關(guān)節(jié)破壞 對(duì)小鼠踝關(guān)節(jié)行HE 染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠滑膜層顯著增生（箭頭指向），關(guān)節(jié)軟骨損傷明顯，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（方框標(biāo)記）。OMT和DXMS治療后，滑膜輕度增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯改善（圖2）。

圖2 OMT對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響Fig.2 Effect of OMT on histopathology of CIA mice joints

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)小鼠后肢踝關(guān)節(jié)滑膜Bcl-6（圖3A）、CXCR5（圖3B）的表達(dá)水平。使用Image J對(duì)陽(yáng)性部分進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3C、D所示，與模型組相比，OMT 和DXMS 治療后表達(dá)水平明顯降低。

圖3 OMT 降低了組織中Bcl-6和CXCR5的表達(dá)（×400）Fig.3 OMT reduced Bcl-6 and CXCR5 expressions in tissue（×400）

2.3 OMT 降低CIA 小鼠的脾指數(shù) 脾臟的重量與其功能以及其中免疫細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。與正常組相比，模型組小鼠脾指數(shù)明顯增高，而OMT 和DXMS治療后，脾指數(shù)顯著降低（圖4）。

圖4 OMT對(duì)脾指數(shù)的影響Fig.4 Effect of OMT on spleen index

2.4 OMT 可調(diào)節(jié)小鼠血清中的細(xì)胞因子并抑制CⅡ-Ab的水平 用ELISA檢測(cè)血清中CⅡ-Ab和各種炎癥因子的表達(dá)（圖5）。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組IL-21 和自身抗體CⅡ-Ab 的濃度明顯升高，IL-10 和 TGF-β 降低。而 OMT 和 DXMS 治療后可下調(diào)血清中CⅡ-Ab的分泌和IL-21，上調(diào)IL-10和TGF-β的表達(dá)水平。結(jié)果表明，OMT 對(duì)CIA 小鼠的癥狀和免疫炎癥有治療作用。

圖5 OMT對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effect of OMT on cytokines expression in serum

2.5 OMT 減少 CIA 小鼠脾 Tfh 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的比例 從小鼠脾臟中分離細(xì)胞并使用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞和GL-7+B220+B細(xì)胞的百分比。與正常對(duì)照組相比，CIA小鼠脾臟中檢測(cè)到更高頻率的Tfh細(xì)胞（圖6A）且模型組CXCR5+細(xì)胞比例升高明顯，B細(xì)胞亦增高（圖6B）。在OMT和DXMS組中，Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞的頻率顯著降低。結(jié)果表明，OMT可抑制脾臟中B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制免疫應(yīng)答中抗體的產(chǎn)生。

圖6 OMT對(duì)小鼠脾臟中Tfh和B細(xì)胞比例的影響Fig.6 Effect of OMT on proportions of Tfh and B cells in spleen

2.6 OMT 下調(diào)脾細(xì)胞Bcl-6 mRNA 而上調(diào)Blimp-1 mRNA 的表達(dá) 從小鼠脾細(xì)胞中提取總RNA，并通過RT-qPCR 檢測(cè)Tfh 細(xì)胞關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（圖7）。結(jié)果表明，OMT 可下調(diào)CIA 小鼠脾細(xì)胞中Bcl-6 mRNA的表達(dá)，上調(diào)Blimp-1 mRNA的表達(dá)。

圖7 OMT 下調(diào) CIA 小鼠 Bcl-6 mRNA 但上調(diào) Blimp-1 mRNA的表達(dá)Fig.7 OMT down-regulate Bcl-6 but up-regulate Blimp-1 mRNA expression in CIA mice

3 討論

RA 是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要癥狀的自身免疫性疾病［13］。Tfh 細(xì)胞是 RA 發(fā)病機(jī)制中的重要參與者，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞異常途徑活化，并產(chǎn)生自身免疫性抗體，從而參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［14］。Tfh 細(xì)胞的分化受復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，這些轉(zhuǎn)錄因子包括正向調(diào)控因子［如B細(xì)胞淋巴瘤因子6（Bcl-6）、激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF-3）、基本亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（Batf）、干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）等］和負(fù)向調(diào)控因子［如B 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1（Blimp-1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5）、干擾素調(diào)節(jié)因子 8（IRF8）等］［15］。其中 Bcl-6 是 Tfh 細(xì)胞的重要信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子［16］，它能夠促進(jìn)生發(fā)中心Tfh 細(xì)胞的活化及B 淋巴細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)CXCR5的表達(dá)。CXCR5 的高表達(dá)水平，可以引導(dǎo)Tfh 細(xì)胞遷移到B細(xì)胞卵泡的受體［17］。

OMT 堿是從苦參中提取的一種具有多種藥理作用的生物堿。既往研究表明，OMT 具有抗炎、抗肝纖維化、抗腫瘤及降低血糖的功效［18-20］。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果證實(shí)，采用氧化苦參堿治療大鼠CIA模型療效明顯，可降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，抑制關(guān)節(jié)滑膜增生，但其是否調(diào)控Tfh 細(xì)胞和B 細(xì)胞尚不清楚［21］。本實(shí)驗(yàn)通過建立 CIA 模型，探討 OMT 是否可以通過調(diào)節(jié)Tfh 細(xì)胞、B 細(xì)胞的功能來緩解RA 的進(jìn)展。在本研究中采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了小鼠關(guān)節(jié)Bcl-6、CXCR5 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在CIA 模型中Bcl-6、CXCR5 表達(dá)上調(diào)；OMT 干預(yù)后，Bcl-6、CXCR5表達(dá)明顯降低。Blimp-1 是Bcl-6 的拮抗因子，主要參與成熟B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，并且在維持漿細(xì)胞的特殊處理及分泌保護(hù)性自身抗體的過程中起到非常重要的作用，直接抑制T 細(xì)胞和B 細(xì)胞Bcl-6 的表達(dá)。在Tfh 細(xì)胞的分化中，Bcl-6/Blimp1扮演相互拮抗的調(diào)節(jié)劑［15］。本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR 檢測(cè)了轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，OMT 組 Bcl-6 表達(dá)降低而Blimp-1 表達(dá)升高（圖8）。提示OMT 可能通過下調(diào)Bcl-6、CXCR5，上調(diào)Blimp-1的表達(dá)來緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)炎。

圖8 OMT調(diào)節(jié)Tfh-B細(xì)胞功能的可能機(jī)制Fig.8 Possible mechanism of OMT regulating function of Tfh-B cells

在自身免疫性疾病中，免疫調(diào)節(jié)因子也起到了非常重要的作用。IL-21 主要由活化的CD4+T 細(xì)胞分泌，尤其是Tfh細(xì)胞，對(duì)生發(fā)中心的形成、功能及B細(xì)胞分化、成熟等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)Bcl-6/Blimp-1的表達(dá)［22］。IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，體內(nèi)最主要來源是單核巨噬細(xì)胞和輔助性T 細(xì)胞，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，直接參與炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子［23］。TGF-β 主要來源于樹突狀細(xì)胞，抑制 B 細(xì)胞的增殖和淋巴細(xì)胞的分化，是Tfh 細(xì)胞調(diào)節(jié)和分化的重要免疫調(diào)節(jié)劑［24］。在本研究中，IL-10、TGF-β可能通過抑制Tfh-B 細(xì)胞的分化成熟，降低自身抗體的分泌，共同協(xié)調(diào)機(jī)體免疫平衡。有研究證明，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）可分泌IL-10及TGF-β因子，Treg細(xì)胞水平與IL-10及TGF-β因子的分泌成正比［25-26］。推測(cè) Treg 細(xì)胞與 Tfh 細(xì)胞的平衡可能與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，OMT 可能通過上調(diào) IL-10、TGF-β 的表達(dá)，抑制自身抗體CII-Ab的表達(dá)，降低IL-21的水平，從而減少小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，改善骨破壞。

綜上所述，OMT 可能通過抑制Tfh 細(xì)胞的分化，阻斷B細(xì)胞的活化，減少自身抗體的分泌，進(jìn)而保護(hù)小鼠骨組織。本研究為OMT 的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但具體的免疫學(xué)分子機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。