預后標志物STEAP1與肺腺癌免疫浸潤相關①

高維龍 梁貴友 郭 強 陳開遠 （貴州醫科大學，貴陽550025）

2018 年全球癌癥研究中心數據顯示，肺癌是當前對人類健康和生命威脅最嚴重的腫瘤之一，其發病率和死亡率位居各類惡性腫瘤前列［1］。肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 是肺癌的主要類型，占肺癌總 數 的 85%［2-3］。 肺 腺 癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常見的侵襲性NSCLC，約占所有肺癌的40%，且常規治療手段目前效果欠佳［4-5］。隨著篩選方法進步、體檢率上升及煙草使用減少，肺癌早期診斷率提高，且最近由肺癌導致的死亡率在男性和女性中分別下降48%和23%。但由于疾病進展的隱匿性，仍有多數患者在診斷時已失去手術機會，且對化療和放療效果反應不佳，5 年生存率低至15%［6-7］。盡管靶向治療和新型免疫治療給NSCLC，尤其是LUAD 患者帶來了新的希望，但預后較差。目前缺乏針對NSCLC 患者不良預后和治療預測的生物標志物。因此，急需尋找新型生物標志物鑒定肺癌患者中預后不良的高危患者，以便早期診斷，強化治療方案以改善其預后。

新近發現的前列腺跨膜上皮抗原1（six-transmembrane epithelial antigen of prostate-1，STEAP1）是由6 個跨膜結構域組成的細胞表面生物分子，作為轉運蛋白參與細胞間轉運而發揮重要作用［8-10］。此外，STEAP1 可調節活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平刺激腫瘤細胞生長［11-12］。目前，STEAP1在腫瘤組織和非腫瘤組織中表現出極大的組織特異性，在前列腺癌、膀胱癌、結直腸癌、腎癌等組織中表達增高，但在乳腺癌、子宮內膜癌組織中表達降低［8，12-19］。研究表明，STEAP1 水平與腫瘤患者臨床病理特征及不良預后顯著相關［9，13-14，18-19］。說明STEAP1 可能參與腫瘤發生發展，STEAP1 可能是早期疾病診斷及腫瘤治療的潛在靶點和生物標志物。

此外，腫瘤與免疫系統相互作用在腫瘤發生、發展和治療中起重要作用。近年免疫治療被認為是腫瘤治療的新希望，如細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA4）、程序性死亡-1（PD-1）和程序性死亡配體-1（PD-L1）抑制劑等在惡性黑色素瘤和NSCLC中顯示出良好的抗腫瘤作用。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）和腫瘤浸潤性中性粒細胞（TINS）影響腫瘤化療和免疫治療預后及療效。因此，尋找新型免疫相關治療靶點以改善LUAD 患者預后尤為重要。但STEAP1 在LUAD 中的表達、臨床病理特征、預后及可能發病機制尚未明確。因此，本研究通過多種在線數據庫分析STEAP1 與LUAD 患者臨床病理特征和預后的相關性，探究其潛在價值。

1 資料與方法

1.1 Onconine 分 析 Oncomine（https：//www. oncomine. org/resource/login. htm）基因表達微陣列數據庫是一種可訪問的在線微陣列數據庫，用戶可了解全基因組表達相關研究［20］。Oncomine 可用于分析LUAD 中STEAP1 RNA 水平，篩選條件為P＜0.000 1；倍數變化=1.5；數據類型為mRNA；分析類型：癌組織vs正常組織。

1.2 UALCAN 分 析 UALCAN （http：//ualcan.path.uab.edu）是對TCGA 基因表達數據進行深層次分析的公開數據庫［21］。本研究通過UALCAN 分析STEAP1 在 LUAD 和正常樣本的表達、與 LUAD 臨床病理學特征（癌癥階段、腫瘤分級、種族、體重或分期等）的相關性及潛在預后價值。

1.3 PrognoScan、Lung cancer explorer、Kaplan-Meier plotter 和GEPIA 數據庫 本研究通過PrognoScan（http：//www. abren. net/PrognoScan/）、Lung cancer explorer（http：//lce.biohpc.swmed.edu/）和Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot. com/analysis/）在線數據庫分析STEAP1 表達與LUAD 患者預后的相關性［22-25］。 另 外 ，通 過 GEPIA（http：//gepia. cancerpku.cn/）分析鑒定數據庫中相關性較強的LUAD 浸潤細胞免疫標志物基因與STEAP1 表達的相關性。Spearman 法分析兩者相關性強弱。X 軸為STEAP1，其他Timer數據庫中顯著相關基因為Y軸。

1.4 Timer 數 據 庫 Timer（https：//cistrome. shinyapps. io/timer/）是一個系統分析多種腫瘤免疫浸潤的數據庫［26］。免疫浸潤細胞包括B 細胞、CD4+T細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等。通過基因表達模塊分析STEAP1 在不同類型癌癥中的表達及其表達水平與LUAD 免疫浸潤細胞的相關性。相關性分析評價STEAP1表達與腫瘤浸潤細胞免疫基因標志物［B 細胞、M1 型巨噬細胞、M2 型巨噬細胞、DC、Th1 細胞、Th2 細胞、濾泡輔助T 細胞（Tfh）細胞、Th17 細胞］的相關性。

1.5 統計學分析 采用SPSS25.0 軟件進行統計學分析，GraphPad Prism5 軟件作圖。組間相關性采用相關性分析進行檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STEAP1在LUAD中表達升高 采用Oncomine數據庫比較NSCLC 組織和正常組織中STEAP1轉錄水平，結果顯示，STEAP1 在神經系統腫瘤、乳腺癌、子宮頸癌、直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌癥、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤等腫瘤組織中表達上調，而在少數腫瘤，如膀胱癌、乳腺癌和肝癌中表達降低（圖1A）。采用Timer 數據庫進一步分析STEAP1 在各種腫瘤中的表達，發現食管癌、胃癌、頭頸部癌癥、肺鱗癌、肺腺癌等癌癥中STEAP1 表達上調，而乳腺癌、膽管癌、腎細胞癌等腫瘤組織中STEAP1 表達降低（圖1B）。進一步在Oncomine 數據庫中以P＜0.05，倍數變化1.5，數據類型mRNA 和類型為LUAD vs 正常肺組織為篩選條件，發現有6 個數據集顯示STEAP1 在LUAD 組織中表達升高（圖2A）。多數據中心來源的Lung cancer explorer 數據庫中對STEAP1 表達水平進行 Meta 分析發現，STEAP1 在LUAD 中表達升高（圖2B），提示高表達STEAP1 的患者預后不良。

圖1 STEAP1在人腫瘤組織中的表達Fig.1 STEAP1 expression in human tumor tissues

圖2 STEAP1在人LUAD中的表達Fig.2 STEAP1 expression in human LUAD

2.2 STEAP1 表達與LUAD 患者臨床病理特征相關 采用UALCAN 數據庫分析STEAP1 表達與LUAD 患者臨床病理學特征的相關性以預測STEAP1 表達在LUAD 中的價值，結果顯示，STEAP1表達水平與患者吸煙、癌癥分期、組織亞型和淋巴結轉移相關，表明STEAP1表達水平與LUAD發生發展相關（表1）。

表1 STEAP1表達與LUAD患者臨床病理特征相關性分析Tab.1 Correlation analysis between STEAP1 expression and clinical pathology of LUAD patients

2.3 STEAP1 在LUAD 患者中的預后價值 采用PrognoScan、Lung Cancer Explorer、GEPIA 和 Kaplan-Meier Plotter 等數據庫評估STEAP1表達對LUAD 患者生存率的影響，發現STEAP1表達與LUAD患者預后相關。HARVARD-LC 數據集顯示，STEAP1 低表達 LUAD 患 者 OS 較 好（HR=1.67，95%CI=1.22~2.27，COXP=0.001 314，圖3A）。Jacob-00182-MSK、GSE13213、GSE13213、Jacob-00182-UM 數據集均顯示，STEAP1 低表達 LUAD 患者 OS 更好（HR=1.90，95%CI=1.23~2.94，COXP=0.003 880；HR=1.25，95%CI=1.03~1.51，COXP=0.021 018；HR=1.26，95%CI=1.04~1.54，COXP=0.020 190；HR=1.47，95%CI=1.14~1.90，COXP=0.002 949，圖 3B~E）。GSE31210 數據集顯示，STEAP1 低表達 LUAD 患者具 有 較 好 的 RFS（HR=1.49，95%CI=1.15~1.94，COXP=0.002 737，圖3F）。采用TCGA、Lung cancer explorer和Kaplan-Meier Plotter數據庫進一步分析發現，高表達STEAP1 的LUAD 患者比低表達STEAP1的患者預后更差（圖4、5）。表明STEAP1 表達可能是LUAD預后不良的危險因素。

圖3 PrognoScan數據庫評估STEAP1表達與預后的相關性Fig.3 Relationship assessment between STEAP1 expres?sion and prognosis by PrognoScan database

圖4 Meta 分析評估 Lung cancer explorer 數據庫中STEAP1水平與預后的相關性Fig.4 Relationship assessment between STEAP1 level in Lung cancer explorer database and prognosis by Meta analysis

2.4 STEAP1表達與LUAD 患者預后相關臨床病理學特征分析 采用Kaplan-Meier 繪圖儀中研究STEAP1 表達與LUAD 患者預后相關臨床病理學特征的關系，結果顯示，STEAP1 表達水平與LUAD 患者預后相關性別、吸煙、癌癥分期、AJCC 分期相關，即STEAP1 表達水平與LUAD 患者OS 相關男性患者、 2 級臨床分期、AJCC T1 分期、AJCC N0 分期和AJCC M0 分期相關，STEAP1 表達水平與 LUAD 患者RFS 相關女性和男性患者、非吸煙患者、AJCC T2 分期、AJCC N0分期和AJCC M0分期相關（表2）。

表2 STEAP1表達與LUAD患者預后相關臨床病理學特征相關性分析Tab.2 Correlation analysis between STEAP1 expression and clinical pathology related to prognosis in LUAD patients

2.5 STEAP1表達水平與LUAD 免疫浸潤細胞水平相關 為進一步探究STEAP1 表達在腫瘤免疫浸潤方面的價值，分析Timer 數據庫中STEAP1 表達水平與LUAD 浸潤淋巴細胞相關性，結果顯示，STEAP1表達水平與LUAD 免疫浸潤細胞（腫瘤純度）、B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、嗜中性粒細胞和 DC 顯著相關（P＜0.05，圖6）。為研究STEAP1 與LUAD 免疫浸潤細胞的相關性，課題組采用Timer 和GEPIA數據庫重點分析STEAP1 與LUAD 各種免疫細胞（CD8+T 細胞、T 細胞、B 細胞、單核細胞、TAMs、M1、M2型巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞和DC等）免疫標志物的相關性。Timer 數據庫結果顯示，STEAP1表達水平與LUAD 免疫浸潤細胞（CD8+T 細胞、T 細胞、B 細胞、單核細胞、TAM、M1、M2 型巨噬細胞、嗜中性粒細胞、NK細胞、DC、Th1、Th2、Tfh、Th17細胞、Treg 和衰竭T 細胞）免疫標志物顯著相關，即LUAD中，STEAP1 表達水平與CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL3、KIR2DL4 等免疫標志物顯著相關。進一步采用GEPIA 數據庫驗證STEAP1表達與LUAD 免疫浸潤細胞的相關性，結果顯示，STEAP1 表達與 LUAD 浸潤細胞 CD8+T 細胞、T細胞、單核細胞等顯著相關，即STEAP1 表達與LUAD 免疫標志物CD8A、CD8B、CD3D、CD2、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL4、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、BCL6、IL21、CCR8、STAT5B、PDCD1、LAG3、HAVCR2 和 GZMB 顯著相關（圖 7）。GEPIA 分析結果與Timer 數據庫結果一致（表3），表明STEAP1 在LUAD 免疫浸潤細胞中具有重要調節作用，可能是腫瘤免疫逃逸過程中的重要一員。

表3 STEAP1表達與LUAD腫瘤浸潤細胞免疫標志物相關性分析Tab.3 Correlation between STEAP1 expression and im?mune markers of tumor infiltrating cells in LUAD

圖6 STEAP1表達與LUAD腫瘤浸潤細胞相關性Fig.6 Correlation between STEAP1 expression and tumor infiltrating cells in LUAD

圖7 STEAP1表達水平與LUAD腫瘤浸潤細胞免疫標志物相關性分析Fig.7 Correlation analysis between STEAP1 expression and immune markers of tumor infiltrating cells in LUAD

3 討論

近年STEAP1 逐漸被人們熟知，在多種腫瘤中的表達及功能已有相繼報道，其中前列腺癌研究較多。多項研究表明，STEAP1 是前列腺癌的潛在生物標志物和免疫治療靶點。STEAP1 在前列腺癌組織中表達增高，STEAP1 基因表達增高與前列腺癌患者高Gleason 評分、精囊侵襲、復發及預后不良顯著相關［8，13-14］。同時，敲低前列腺癌細胞中 STEAP1基因表達，可抑制癌細胞增殖，促進其凋亡［8］。此外，STEAP1262-270肽可誘導具有活力和功能的抗原特異性CTL，有望成為晚期前列腺癌治療的新方法［27-28］。但STEAP1在LUAD 中的表達及其對LUAD患者的潛在作用和預后的影響鮮有報道。因此，本研究著重探討STEAP1 在LUAD 中的作用及潛在臨床價值。

本研究采用多數據庫分析RNA 測序數據，探究STEAP1 在LUAD 中的潛在臨床價值，發現STEAP1在LUAD患者癌組織中表達增高，高表達STEAP1與LUAD 臨床病理特征（患者吸煙、癌癥分期、組織亞型和淋巴結轉移）和生存時間相關，且STEAP1 高表達患者多預后不良。Meta 分析進一步證實其結果的可靠性，表明STEAP1有望成為LUAD治療的新靶點和預后標志物。

此外，免疫浸潤和腫瘤微環境對各種腫瘤發生發展起重要作用，腫瘤分子特征和免疫微環境的動態相互作用可產生不同臨床結果。研究發現，肝癌患者腫瘤組織中OPN 與PD-L1 表達和TAM 浸潤呈正相關，OPN 可促進巨噬細胞趨化作用和選擇性活化，并通過激活巨噬細胞中的CSF1-CSF1R 通路促進 HCC 中 PD-L1 表達，抗 PD-L1 和 CSF1R 抑制劑聯用可增強OPN 抗裸鼠成瘤能力，延長生存期［29］。VISTA 體外可抑制腫瘤細胞增殖，減少細胞因子生成，體內降低腫瘤浸潤CD8+T 細胞數。抗VISTA 抗體顯著延長成瘤小鼠存活時間［30］。本研究發現，STEAP1 與 LUAD 浸潤 B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、嗜中性粒細胞和DC 顯著相關，即STEAP1 表達水平與免疫標志物 CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL3、KIR2DL4 等顯著相關，表明STEAP1 在腫瘤免疫浸潤細胞中具有重要調節作用，與腫瘤免疫逃逸有關。

STEAP1 在腫瘤發生過程中的調節功能可能是雙重的，取決于性別、組織類型和癌癥發展階段等。乳腺癌組織中STEAP1 mRNA 和蛋白表達增高，高表達STEAP1 與ER（estrogen receptor）和腫瘤分級明顯相關［15，31］。但STEAP1在乳腺癌細胞中表達較低，低表達STEAP1 與惡性表型和預后不良有關［9］。STEAP1 高表達可抑制EMT 相關基因 MMP2、MMP9、MMP13、VIM 和 CDH2 表達，增加 CDH1 表達，進而抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移。反之，敲低STEAP1基因表達促進EMT相關基因表達，CDH1表達減少，進而增強乳腺癌細胞侵襲和遷移能力。此外，STEAP1 在子宮內膜癌中表達下調，可抑制子宮內膜癌細胞遷移和侵襲［9］。本研究初步分析STEAP1在LUAD 中的表達，表明其具有重要臨床預后價值。受條件限制，課題組暫時無法獲得相關標本并對其進行驗證。但ZHUANG 等［32］研究中，免疫組化結果顯示，STEAP1 在肺癌組織中升高，一定程度上證實本研究結果的可靠性。

綜上所述，STEAP1可能是LUAD 預后不良的潛在分子標志物，其表達與腫瘤免疫細胞浸潤細胞相關，有助于免疫逃逸的發生。為臨床LUAD 治療提供了新思路。課題組將在以后工作中進行STEAP1功能及機制研究。