S1P/S1PR1通路調節補體B因子的表達對食管鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移的影響①

徐鳳敏 陳昱伶 任 玲 蒙春梅 李倩倩 胡為民 （川北醫學院微生物學與免疫學教研室，南充637100）

食管癌是世界上常見的癌癥之一，主要包括食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌，鱗癌是我國食管癌最主要的病理類型。我國是食管癌發病率和死亡率最高的國家，并且發病率有明顯的地區分布特點，其中，川北地區的鹽亭、南部、閬中等是高發地區之一［1-2］。食管癌因為發現晚、進展快，導致預后較差［3］。本課題組的前期研究發現食管鱗癌的發生發展與1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）/1 型 1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1）通路密切相關：胞漿S1PR1 蛋白在食管鱗癌細胞中表達明顯高于癌旁正常上皮細胞，在低分化的ESCC 組織中比在高分化的組織中表達更高；胞漿S1PR1 促進細胞周期G1/S 期過渡，增強Eca109細胞的遷移能力［4］。課題組也采用有參轉錄組高通量測序技術，發現在食管鱗癌Eca109細胞中過表達S1PR1 導致補體 B 因子（complement factor B，CFB）表達增加。本研究將進一步探究S1P/S1PR1 通路對CFB 的調節，以及CFB 對ESCC 細胞增殖和遷移的影響，為食管鱗癌的發病機制、診斷、治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人食管鱗癌Eca109 細胞、TE-1 細胞、KYSE150 細胞購自中國典型培養物保藏中心，并由本實驗室傳代培養。

1.1.2 主要試劑 包含人S1PR1 全長與EGFP 融合表達的載體S1PR1-EGFP 及其對照載體Control-EGFP由美國麻省總醫院Dr.Wu MX教授惠贈。RPMI1640 培養基、胰酶購自Gibco 公司。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid-free bovine serum albumin，FAF-BSA）購自Sigma 公司。CCK8 試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司。總RNA 提取試劑盒SV Total RNA Isolation System 購自Promega 公司。逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、定量 PCR 試劑盒 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司。ELISA 試劑盒Human CFB（Complement factor B）ELISA Kit 購自武漢菲恩生物科技有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。siRNA 合成于上海吉瑪制藥技術有限公司。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.1.3 儀器 CFX Connect 實時熒光定量PCR 儀、Imark 酶標儀購自美國Bio-Rad 公司，CO2恒溫細胞培養箱購自美國Shellab公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人食管鱗癌細胞株Eca109、TE-1、KYSE150用含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml 的 RPMI1640 培養液，于 37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2.2 RT-qPCR 按照說明書提取細胞的總RNA，測定RNA 濃度和純度，逆轉錄為cDNA。將得到的cDNA以HPRT為內參，按照試劑盒操作方法進行實時熒光定量PCR，檢測目的基因表達情況。PCR 擴增條件為：95℃ 預變性2 min；95℃ 變性15 s，57℃ 退火20 s，72℃ 延伸30 s，共40個循環。65~95℃溶解循環。相應的引物序列如下：S1PR1上游引物：5'-GCTGCTCAAGACCGTAATTATCG-3'，下游引物：5'-ACCAGGAAGTACTCCGCTCTGA-3'；CFB 上游引物：5'-CTGGAGCACCCTGAAGACTC-3'，下游引物：5'-CCGGAGAGTGTAACCGTCAT-3'；HPRT 上 游 引物：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，下游引物：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'。

1.2.3 ELISA 收集細胞的培養上清于-80℃凍存，按照ELISA 試劑盒說明書操作，標準品倍比稀釋。在酶標儀450 nm 處測得OD 值，繪制標準曲線，根據標準曲線求出蛋白濃度，并進行相應計算。

1.2.4 細胞轉染

1.2.4.1 質粒轉染 Eca109細胞接種于6孔板，培養24 h后換成含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養液，用 LipofectamineTM2000 分別 轉染 S1PR1-EGFP 與Control-EGFP 載體，操作按說明書進行。6 h 后再次換含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養液，48 h收集細胞。

1.2.4.2 siRNA 轉染 TE-1 細胞接種于 6 孔板、12 孔板或 96 孔板，培養 24 h 后換成含 0.1%FAFBSA RPMI1640 培養液，用 LipofectamineTM2000 按照說明書分別轉染NC siRNA、CFB siRNA1 與CFB siRNA2。6 h 后再次換含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養液，在不同培養時間內進行相應檢測。CFB siRNA1 正義鏈序列：5′-GCGGCGAACGUGUCAGGAATT-3′，反義鏈序列：5′-UUCCUGACACGUUCGCCGCUG-3′；CFB siRNA2 正 義 鏈 序 列 ：5′-AGAUGACGUCCCUCCUGAATT-3′，反義鏈序列：5′-UUCAGGAGGGACGUCAUCUGG-3′；陰性對照NC siRNA 正 義 鏈 序 列 ：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.4.3 共轉染 Eca109 細胞接種于12 孔板或96 孔板，CO2培養箱培養24 h 后按照共轉染說明書以LipofectamineTM2000 分別轉染Control-EGFP+NC siRNA、S1PR1-EGFP+CFB siRNA1、S1PR1-EGFP+CFB siRNA2、S1PR1-EGFP+NC siRNA。6 h 后均換液為含0.1%FAF-BSA RPMI1640 培養液，后在不同培養時間進行相應檢測。

1.2.5 CCK8 法檢測細胞增殖 TE-1 細胞或Eca109 細胞接種于96 孔板，24 h 后分別轉染相應siRNA、siRNA+質粒。第0、1、2、3 天每孔加入10 μl CCK8試劑，酶標儀450 nm處檢測OD值。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 取12孔板底部用碳素筆畫三道橫線，TE-1細胞或Eca109細胞接種于12 孔板中，24 h 細胞貼壁后用 100 μl 槍頭垂直于孔內劃一道豎痕，換含0.1%FAF-BSA RPMI1640 培養液，進行0 h 拍照，后按照說明書在各孔分別轉染相應siRNA、siRNA+質粒。72 h 時對同一視野進行拍照，得到的圖片通過Image J 軟件進行處理，計算細胞遷移率。

1.3 統計學處理 采用統計學軟件SPSS23.0分析實驗數據，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Eca109、TE-1、KYSE150 細胞中S1PR1、CFB 的表達情況 采用RT-qPCR 方法檢測食管鱗癌細胞株中 S1PR1、CFB mRNA 表達量，結果如圖 1 所示，S1PR1 mRNA 在TE-1 細胞中表達量遠高于Eca109和 KYSE150 細胞（P＜0.001），CFB mRNA 在 TE-1 細胞中表達量最高，在Eca109、KYSE150 細胞中表達量低（P＜0.001）。結果顯示在3 種細胞中，TE-1 細胞 高 表 達 S1PR1、CFB；Eca109 細 胞 中 低 表 達S1PR1、CFB，因此選擇 Eca109 細胞過表達 S1PR1，TE-1細胞敲低CFB來進行后續試驗。

圖1 Eca109、TE-1、KYSE150 細胞中 S1PR1、CFB mRNA的表達情況Fig.1 Expressions of S1PR1 and CFB mRNA in Eca109，TE-1 and KYSE150 cells

2.2 S1PR1過表達對Eca109細胞中CFB的影響 對Eca109細胞轉染S1PR1-EGFP、Control-EGFP 48 h后，結果證實過表達S1PR1 的Eca109 細胞的S1PR1表達水平顯著升高，明顯高于對照組（P＜0.001，圖2A），此外，相比于對照組，過表達S1PR1 后Eca109 細胞的CFB mRNA 表達水平顯著增加（P＜0.01，圖2B），與有參轉錄組高通量測序的結果吻合。

圖2 S1PR1過表達Eca109細胞中CFB mRNA表達情況Fig.2 Expression of CFB mRNA in S1PR1-overexpress?ing Eca109 cells

2.3 TE-1 細胞中敲低CFB 表達 高表達CFB 的TE-1 細胞轉染 CFB siRNA1 或 CFB siRNA2 后，48 h收集細胞做RT-qPCR，結果如圖3A 所示。48 h收集細胞上清做ELISA，結果如圖3B 所示。相比于NC siRNA組，轉染了CFB siRNA1或CFB siRNA2的TE-1細胞的CFB mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001），分泌CFB水平明顯降低（P＜0.05）。

圖3 TE-1細胞中敲低CFB表達Fig.3 Knockdown of CFB in TE-1 cells

2.4 S1PR1-EGFP 與 CFB siRNA 共轉染對 Eca109細胞CFB 分泌的影響 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA共轉染Eca109 細胞，于72 h 時收集細胞上清做ELISA，結果如圖 4 所示，S1PR1-EGFP+NC siRNA 的CFB 分泌水平高于 Control-EGFP+NC siRNA（P＜0.01）。 而 S1PR1-EGFP+CFB siRNA1 和 S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 的CFB 分泌水平低于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。

圖4 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共 轉 染 對 Eca109 細 胞CFB分泌的影響Fig.4 Effects of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotrans?fection on secretion of CFB in Eca109 cells

2.5 S1PR1-EGFP 與 CFB siRNA 共轉染對 Eca109細胞增殖和遷移的影響 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA 共轉染 Eca109 細胞，于第 0、1、2、3 天分別用CCK8 法測定各組 OD 值，結果如圖 5 所示，S1PR1-EGFP+NC siRNA 增殖能力大于Control-EGFP+NC siRNA（P＜0.001）。而S1PR1-EGFP+CFB siRNA1 和S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 的增殖能力小于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA 共轉染 Eca109 細胞，72 h 后拍照并計算細胞遷移率，結果如圖6 所示，轉染72 h 后，S1PR1-EGFP+NC siRNA 組遷移率大于Control-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。而S1PR1-EGFP+CFB siRNA1組和S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 組的遷移率均小于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。

圖5 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共轉染對 Eca109 細胞增殖的影響Fig.5 Effect of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotransfec?tion on proliferation of Eca109 cells

圖6 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共轉染對 Eca109 細胞遷移的影響Fig.6 Effect of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotransfec?tion on migration of Eca109 cells

2.6 敲低CFB 對TE-1 細胞增殖和遷移的影響 CCK8 結果顯示，與陰性對照相比，TE-1 細胞轉染CFB siRNA1、CFB siRNA2 后，在第2 天開始，其增殖能力受到抑制，于第3 天時更加明顯（P＜0.05；P＜0.001，圖 7）。轉染了 CFB siRNA1、CFB siRNA2 的TE-1 細胞，通過 Image J 分析劃痕，發現 72 h 后其遷移率小于陰性對照組細胞（P＜0.001，圖8）。

圖7 敲低CFB對TE-1細胞增殖的影響Fig.7 Effect of CFB knockdown on proliferation of TE-1 cells

圖8 敲低CFB對TE-1細胞遷移的影響Fig.8 Effect of CFB knockdown on migration of TE-1 cells

3 討論

目前已鑒定的S1P 的高親和力受體有5 型，即S1PR1~5，S1P 受體均可與S1P 以較高的親和力結合參與增殖、遷移和血管生成等關鍵的細胞過程［5］。S1P 主要為鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPHK）活化鞘氨醇（sphingosine，SPH）而產生，目前，SPHK1和SPHK2 是已知磷酸化SPH 產生S1P 的兩個激酶，能被包括多種細胞因子在內的生物活性分子誘導轉錄和活化，產生 S1P［6-10］。細胞內產生的 S1P 經過轉運蛋白分泌到細胞外，以自分泌、旁分泌和/或內分泌方式作用于受體而發揮其功能。S1P/S1PRs通路在腫瘤生物學中發揮重要作用，包括胃癌、結腸癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤的增殖、浸潤和轉移［11-12］。S1PR1 參與腫瘤發生，與多種腫瘤的遷移、增殖和侵襲有關［13］。在低表達 S1PR1 和 CFB 的Eca109 細胞中過表達S1PR1，結果顯示誘導CFB 表達上調，促進細胞的增殖和遷移，并且干擾CFB 表達可抑制Eca109 細胞的增殖和遷移；在高表達S1PR1 和 CFB 的 TE-1 細胞中單獨敲低 CFB 的表達，TE-1 細胞的增殖和遷移也會受到明顯抑制，說明S1P/S1PR1 通路能誘導CFB 表達，促進食管鱗癌細胞的增殖和遷移，CFB 可能在食管鱗癌的發生發展中發揮重要作用。

CFB 為補體系統重要組分之一，參與補體激活的旁路途徑和正反饋放大環。在腫瘤患者和小鼠模型中，發現幾種補體基因的表達增加，導致血漿或其他體液中補體的濃度高于正常。早期的研究認為，補體可以通過細胞毒作用參與抗腫瘤免疫效應機制。針對腫瘤細胞表面抗原的抗體與其結合，通過經典途徑激活補體，形成攻膜復合物（membrane attack complex，MAC）導致腫瘤細胞溶解，即補體依賴的細胞毒（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用。然而，近年來研究顯示，越來越多的證據似乎支持相反的觀點：補體不僅沒有起到抑制腫瘤的作用，反而促進了腫瘤的發展。在卵巢癌模型中，腫瘤細胞中補體活化產生的補體片段C3a 和C5a，以自分泌方式調節腫瘤細胞的增殖和侵襲［14］。沉積在幾種人類惡性腫瘤和小鼠腫瘤中的C1q通過其促血管生成和直接調節腫瘤細胞動力和增殖來加速腫瘤生長［15］。RIIHILA 等［16］發現皮膚鱗狀細胞癌細胞表達 C3、CFB 促進腫瘤的生長。BOIRE 等［17］用4 種不同的人類腫瘤細胞株，發現癌細胞產生和分泌的C3可能有助于其存活和軟腦膜轉移。此外，補體也在腫瘤微環境以及上皮-間質轉化中發揮重要作用［18-20］。

綜上所述，本研究發現S1P/S1PR1 通路能誘導CFB表達，促進食管鱗癌細胞的增殖和遷移，CFB可能在食管鱗癌的發生發展中發揮重要作用。CFB或可作為腫瘤免疫治療的一個新的靶點，并開發針對性的抗體和抑制劑。本研究對S1P/S1PR1 通路調控CFB 的初步探索也為后續的機制研究和臨床治療提供了一個新的思路。