補體C9缺陷對LPS誘導的小鼠早期肝臟炎癥和損傷的保護作用及機制①

吳艷紅 付曉燕 于 洋 吳沛恩 許 虎 房佩佩 魏 濤 梁淑娟

（濰坊醫學院基礎醫學院，山東省高校免疫學重點實驗室，濰坊261053）

內毒素性休克是由宿主對感染的免疫反應失調引起的致命性疾病，通常引發多器官功能障礙，包括肺、腎、肝臟［1-2］。LPS是革蘭氏陰性細菌外膜的組成成分，其誘導的內毒素血癥模型是研究敗血癥及敗血癥休克病理生理學的重要工具［3］。研究證明LPS 與 CD14 和 Toll 樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）相互作用激活炎癥信號并誘導促炎細胞因子的分泌，刺激炎癥細胞向靶器官浸潤從而導致組織損傷［4-6］。肝臟由于其獨特的解剖位置，經常高度暴露于循環抗原、內毒素甚至微生物中，是抵御炎癥的重要防線。肝臟可通過清除細菌、急性期蛋白以及對炎癥代謝的適應等機制，對全身感染期間免疫防御的調節至關重要，同時肝臟也是內毒素休克相關損傷的重要靶標和受累器官［7-8］。

補體系統在先天性和適應性免疫反應中均起重要作用，補體激活最終形成膜攻擊復合物（MAC或C5b-9）。MAC 由C5b、C6、C7、C8和多個C9組成，組裝形成環形孔嵌入靶細胞膜從而裂解細胞，補體C9 是 MAC 發揮作用的重要成分［9］。近年來的研究進一步證明MAC是多種炎癥的重要驅動因素，本課題組前期研究表明C9基因缺陷能夠保護小鼠免于LPS 誘導的休克性死亡，其機制與下調小鼠體內炎癥反應有關［10］。為進一步闡明 MAC 在 LPS 誘導的內毒素休克中的相關病理機制，考慮到肝臟是內毒素休克中多器官損傷的重要靶器官，本研究重點探討了補體C9缺陷在LPS 誘導的早期肝臟炎癥反應和損傷中的作用及病理機制，從而為臨床上內毒素血癥中肝臟損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型B6. WT（C57BL/6）、補體C9基因缺陷型（B6.C9-/ -）小鼠飼養在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環境中。所有動物研究皆根據濰坊醫學院動物保護與使用委員會批準的方案進行。試驗對象為8~10 周齡小鼠。LPS（0111：B4）購自 Sigma-Aldrich；ALT 和 AST 測試盒購自南京建成生物工程研究所；山羊血清購自北京中杉金橋。IF 檢測用的大鼠抗小鼠F4/80-Alexa Fluor 647（F4/80-647）、兔抗小鼠 C5b-9 抗體購自Abcam；大鼠抗小鼠Gr-1 抗體購自BioLegend；山羊抗大鼠 IgG（H+L）-FITC 購自 Invitrogen；山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647 購 自 Jackson Immuno Research。FACS檢測用的大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體、F4/80-APC、CD11b-FITC、CD11b-PE、Gr-1-APC、Ly6C-FITC、Ly6G-APC 均購自 Biolegend。RIPA 裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio；小鼠IL-1β、TNF-α 檢測試劑盒購自eBioscience；小鼠IL-8 檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；sMAC 檢測試劑盒購自Miobiosource；逆轉錄試劑盒購自Thermo scientific；qPCR 試劑盒購自羅氏公司；紅細胞裂解液購自Solarbio；多聚甲醛購自 sigma-Aldrich；Percoll 購自GE Healthcare。BioTek?酶標儀購自美國 Thermo 公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Light‐Cycler?480 Ⅱ購自羅氏公司；冷凍切片機購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS 誘導 取 8~10 周齡的 B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠，分為LPS 組（n=5）和對照組（n=3），LPS 組腹腔注射LPS（5 mg/kg），對照組注射等體積的生理鹽水，12 h后處死小鼠，實驗重復3次。

1.2.2 酶法檢測血清中ALT、AST 水平 收集小鼠血清，取5 μl 血清依據試劑盒說明書檢測ALT、AST的水平。

1.2.3 HE 染色觀察肝臟組織病理學改變 肝臟組織經4%多聚甲醛固定后，進行常規石蠟包埋，切片厚度5 μm，經二甲苯及梯度酒精脫蠟水化后，用蘇木素染色5 min，伊紅復染后封片，光學顯微鏡下觀察并采集圖像，觀察肝臟組織的病理損傷和炎癥反應變化。

1.2.4 ELISA 檢 測 血 清 中 IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC 水平 收集小鼠血清，依據ELISA 試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC的水平。

1.2.5 IF 檢測肝臟組織巨噬細胞、中性粒細胞及MAC 沉積 肝臟組織經OCT 包埋，切片5 μm，冷丙酮固定10 min，10%山羊血清封閉1 h，用于后續檢測。檢測巨噬細胞時，組織用0.3%Triton X-100 破膜5 min，加入大鼠抗小鼠F4/80-647 抗體（1∶50），4℃避光孵育過夜，PBS洗滌后DAPI染色5 min，PBS洗滌后加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。檢測中性粒細胞和MAC時，組織先分別與大鼠抗小鼠 Gr-1 抗體（1∶100）、兔抗小鼠 C5b-9 抗體（1∶50）4℃孵育過夜，PBS 洗滌后，再分別與山羊抗大鼠IgG（H+L）-FITC（1∶400）和山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647（1∶400）反應，然后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 ELISA 檢測肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平 50 mg 肝臟組織加入 0.5 ml 預冷的RIPA 裂解緩沖液，冰上裂解10 min，11 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液。依據試劑盒說明書用BCA法檢測組織抽提物的蛋白濃度。依據ELISA試劑盒說明書檢測每200 μg 肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。

1.2.7 qRT-PCR 檢測肝臟中 IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA 水平 小鼠肝臟組織Trizol 法提取總RNA，無RNase 水溶解后使用TAKE3TM超微量檢測系統檢測純度和濃度，完全符合試驗要求。取5 μg RNA依據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，按照表1所顯示的序列由上海鉑尚生物技術有限公司合成引物。取 2 μl cDNA 于 20 μl 反應體系中，實時熒光定量PCR 儀進行 PCR 循環擴增反應，以 β-actin 作為內參，通過 2-ΔΔCt分析 IL-1β、IL-8、TNF-α 的mRNA 水平變化。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.8 FACS 檢測小鼠肝臟單個核細胞中的巨噬細胞及中性粒細胞 摘取小鼠肝臟，冰上研磨并過200 目尼龍網，細胞懸液 650 r/min，4℃ 離心 1 min。收集上清，1 500 r/min，4℃ 離心8 min。棄上清，細胞沉淀加入10 ml 紅細胞裂解液冰上裂解7 min，加入PBS 終止裂解后1 500/rmin，4℃ 離心8 min。棄上清，PBS 洗滌細胞沉淀 1 次，8 ml 40% 的 Percoll 重懸細胞沉淀，2 500/rmin，4℃離心25 min，所得細胞沉淀即肝臟單個核細胞。取1×106個細胞，加入1 μl抗小鼠CD16/CD32 抗體封閉15 min，加入相應細胞群的檢測抗體：CD11b-FITC、F4/80-APC 和 CD11b-PE、Ly6C-FITC 抗體標記巨噬細胞；CD11b-PE、Gr-1-APC 和 CD11b-PE、Ly6G-APC 抗體標記中性粒細胞。避光染色30 min，加入1 ml PBS 洗滌細胞2 次，1 500/rmin，4℃ 離心 5 min，用 400 μl FACS buffer重懸細胞并過濾后上機檢測。

1.3 統計學分析 利用GraphPad Prism 8.0.1 統計軟件進行分析，計量資料以表示，兩組間均數采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補體C9基因缺陷顯著降低小鼠血清中ALT、AST 水平和肝臟損傷及炎癥浸潤 LPS 處理后，首先檢測兩組小鼠血清中ALT、AST 的水平，觀察肝臟功能變化。結果發現，LPS 注射組小鼠血清ALT、AST的水平均明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組，且B6.C9-/ -小鼠血清中ALT、AST 的水平明顯低于B6.WT 小鼠（P<0.001，圖1A、B），提示C9基因缺陷后小鼠肝臟損傷較輕。同時肝臟組織HE 染色表明，LPS 處理后，B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠肝臟組織結構紊亂、肝臟細胞腫脹、間隙減小、局灶性炎癥細胞浸潤，而B6.C9-/ -小鼠肝臟組織上述病理變化明顯輕于B6.WT小鼠（圖1C）。

圖1 血清ALT、AST水平及肝臟病理學改變Fig.1 Serum ALT，AST levels and liver pathological fea?tures

2.2 補體C9基因缺陷降低小鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α 水平 ELISA 檢測兩組小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。結果發現，LPS 注射組小鼠血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS處理后，B6.C9-/ -小鼠血清中 IL-1β（P<0.01，圖 2A）、IL-8（P<0.000 1，圖 2B）、TNF-α（P<0.000 1，圖2C）的水平顯著低于B6. WT小鼠，提示B6.C9-/ -小鼠體內炎癥反應水平低于B6.WT小鼠。

圖2 血清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.2 Levels of IL-1β，IL-8，TNF-α in serum

2.3 補體C9基因缺陷顯著下調小鼠肝臟組織中MAC 沉積及血清中sMAC 的水平 通過MAC 的特異性標志物進行IF 染色，分析肝臟中MAC 沉積情況，結果表明，LPS 組小鼠肝臟組織MAC 沉積顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟中MAC 沉積（圖3A）及熒光強度（P<0.01，圖3B）顯著低于B6.WT小鼠。同時ELISA檢測小鼠血清中sMAC 水平來反映小鼠體內補體活化水平的高低，結果顯示LPS 組小鼠血清中sMAC水平明顯高于各自的生理鹽水對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠血清sMAC 水平顯著低于B6. WT小鼠（P<0.05，圖3C），提示B6.C9-/ -小鼠體內補體活化水平低于B6.WT小鼠。

圖3 肝臟組織MAC沉積情況及血清sMAC水平Fig.3 MAC deposition in liver and serum sMAC level

2.4 補體C9基因缺陷降低肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8 的水平 ELISA 檢測兩組小鼠肝臟組織抽提物（liver tissue extracts，LTE）中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。結果發現，LPS 組小鼠 LTE 中 IL-1β、IL-8水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS處理后，B6.C9-/ -小鼠LTE中IL-1β（P<0.01，圖4A）、IL-8（P<0.05，圖4B）水平顯著低于B6.WT 小鼠，而TNF-α 水平與B6. WT 小鼠相比無顯著性差異（圖4C）。

圖4 肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.4 Levels of IL-1β，IL-8 and TNF-α in liver tissue ex?tracts

2.5 補體C9基因缺陷降低小鼠肝臟中IL-1β mRNA 的表達水平 qRT-PCR 檢測小鼠肝臟中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA水平。結果顯示，LPS組小鼠肝臟IL-1β mRNA 水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟IL-1β mRNA 水平顯著低于B6.WT 小鼠（P<0.05，圖5A），而 IL-8、TNF-α mRNA 水平與 B6.WT 小鼠相比無顯著性差異（圖5B、C）。

圖5 肝臟組織中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達水平Fig.5 Expression levels of IL-1β，IL-8，TNF-α mRNA in liver tissue

2.6 補體C9基因缺陷減少小鼠肝臟組織中巨噬細胞、中性粒細胞的聚集和浸潤 通過巨噬細胞和中性粒細胞的特異性標志物進行IF 染色，分析肝臟中兩群免疫炎癥細胞亞群浸潤的情況。結果表明，LPS組小鼠肝臟組織巨噬細胞（F4/80）、中性粒細胞浸潤（Gr-1）顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟巨噬細胞（圖6A）、中性粒細胞（圖6B）浸潤顯著少于B6.WT小鼠。

圖6 肝臟組織中巨噬細胞、中性粒細胞的浸潤情況Fig.6 Infiltration of macrophages and neutrophils in liver

2.7 補體C9基因缺陷顯著減少肝臟單個核細胞中巨噬細胞及中性粒細胞的比例 小鼠肝臟單個核細胞流式測定結果顯示，LPS 組小鼠肝臟單個核細胞中巨噬細胞和中性粒細胞的比例顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。為了全面分析兩群細胞浸潤水平的變化，使用兩種常用的細胞表面標志對巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤情況進行檢測。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟單個核細胞CD11b+F4/80+、CD11b+Ly6C+巨噬細胞（P<0.01，圖7A、B）及CD11b+Gr-1+、CD11b+Ly6G+（P<0.01，圖7C、D）中性粒細胞比例顯著少于B6.WT小鼠。

圖7 肝臟單個核細胞中巨噬細胞及中性粒細胞的比例Fig.7 Proportion of macrophages and neutrophils in liver mononuclear cells

3 討論

補體系統是先天性免疫的主要組成部分，是先天性和適應性免疫之間的重要紐帶，由多種血漿和膜結合蛋白組成。這些蛋白質在防御病原體以及調節免疫和炎癥過程中起著核心作用［11-12］。補體級聯反應由3種途徑激活：經典途徑、替代途徑和凝集素途徑，3 種途徑于C3 處匯聚，并導致效應分子C3a和C5a 等炎性介質產生，最終匯聚于終末成分C9 及其參與組成的 MAC（或 C5b-9）［13-14］。MAC 的許多促炎作用已將其確立為炎癥的重要驅動因素［15］，例如，ALAWIEH 等［16］研究發現通過抑制補體的激活顯著減弱創傷性腦損傷后的神經炎癥和功能障礙；KUMAR 等［11］研究表明MAC沉積在實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）視網膜中，這導致NLRP3 炎性小體激活并增加IL-1β 的產生。MAC 的炎癥驅動作用使得MAC有可能作為炎癥治療的新靶點，基于補體C9 作為MAC 形成裂解孔隙的最重要成分，本研究利用補體C9基因缺陷的小鼠，更直觀地探究MAC在補體相關疾病發病機理中的作用。

肝臟是重要的免疫器官，具有獨特的免疫細胞群，參與先天性和適應性免疫。LPS 相關的肝損傷是敗血癥及其他系統性肝臟疾病患者發病和死亡的重要原因。臨床研究表明，與急、慢性肝炎，肝硬化和肝細胞癌相關的內毒素血癥的發生率高達75%~95%［17-18］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，可在炎癥動物模型中用于誘導急、慢性組織損傷［19］。已有研究表明補體系統的激活是內毒素休克中病原體防御機制的關鍵事件之一，MAC 形成能夠激活 NLRP3 炎性小體［20］。本研究利用補體C9基因缺陷小鼠探究MAC 在LPS 誘導的肝損傷中的作用及其相關機制。通過檢測小鼠血清AST、ALT 水平和HE 染色觀察肝臟組織病理學變化評估肝臟損傷情況，結果顯示LPS 刺激顯著上調小鼠血清中AST、ALT 水平，同時肝臟HE 染色顯示LPS刺激引起肝臟組織結構紊亂、肝臟細胞腫脹、間隙減小、局灶性炎癥細胞浸潤，而補體C9缺陷顯著減輕了上述病理變化，提示補體C9缺陷對LPS 誘導的小鼠肝損傷起保護作用。研究表明LPS 對TLR4的過度激活以及隨之而來的細胞因子風暴被認為是內毒素休克或敗血癥的基礎，LPS 能與細胞膜的Toll 樣受體4（TLR4）結合，激活下游炎癥信號通路，進而導致炎癥反應和細胞因子的產生，炎性細胞因子的大量產生是器官功能障礙并最終導致死亡的原因［21-23］。為探究補體C9缺陷在保護LPS誘導的肝損傷中涉及的炎癥過程和機制，本研究對相關促炎因子進行了檢測，結果表明補體C9基因缺陷顯著降低 LPS 處理后小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。為確認補體C9 參與LPS 誘導肝損傷的免疫應答過程與MAC 相關，IF 檢測肝臟中MAC 沉積，同時檢測小鼠血清中sMAC 的水平，結果顯示補體C9缺陷顯著下調肝臟中MAC 沉積及血清sMAC 水平，提示補體C9缺陷對LPS 誘導肝損傷的保護作用與下調補體活化和MAC 沉積有關。為探究MAC 在觸發或加速LPS 誘導肝損傷的免疫應答機制，對肝臟中IL-1β、IL-8、TNF-α 蛋白質和 mRNA 水平進行檢測，結果顯示補體C9缺陷顯著降低肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8 水平及肝臟中IL-1β mRNA 水平，提示補體C9缺陷通過下調MAC 抑制肝臟中炎性因子的產生和釋放。LPS 能夠觸發先天性免疫反應，巨噬細胞和中性粒細胞是先天性免疫的兩種細胞類型，在急性炎癥啟動過程中至關重要［24］。本研究通過IF以及FACS 檢測肝臟中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤情況，結果均顯示補體C9缺陷顯著減少肝臟中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，提示MAC通過影響巨噬細胞以及中性粒細胞的炎癥過程誘導或加速了LPS誘導的肝臟損傷。

上述研究結果提示補體C9缺陷后下調了肝臟組織中MAC 沉積，進而減少促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α 的產生和釋放，從而抑制肝臟巨噬細胞及中性粒細胞的聚集和浸潤，減弱了LPS 內毒素休克中的肝臟組織損傷。進一步提示MAC 在LPS 誘導的休克相關的炎癥反應中具有促進肝臟病理損傷的作用，將為臨床內毒素誘導的肝損傷靶向治療方案設計和臨床治療策略提供新的思路。