DSS誘導潰瘍性結腸炎后miR-192表達及相關作用機制

蔡根深 張 晶 王汝朋 （首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院全科醫學科，北京100038）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結直腸黏膜彌漫性炎癥為特征的慢性疾病，其典型臨床癥狀為血腥黏液便，并具有明顯的緩解期與加重期，病程較長，遷延不愈［1］。隨著近年來飲食結構的改變和生活節奏的加快，我國UC 發病率正逐年上升。盡管UC 的具體發病機制尚未明確，但多數學者認為腸道免疫異常及腸黏膜屏障功能障礙在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的發病過程中起著重要作用。異常黏膜免疫反應導致炎癥因子及氧化應激的失衡，而后者又進一步加劇腸黏膜免疫功能的紊亂，進而誘發腸上皮的慢性持續性損傷，最終導致UC的發生發展［2］。

MicroRNAs（miRNAs）是一類能夠在轉錄后參與調節多種基因表達的內源性非編碼RNA［3］。近年來越來越多的數據表明miRNAs 與UC 的發生發展密切相關。WU 等［4］通過 miRNAs 芯片等技術對比分析UC 患者與健康人群的結腸黏膜組織發現，miR-192 在UC 患者中的表達顯著降低。VALMIKI等［5］同樣發現在UC患者腸黏膜組織中包括miR-192在內的多種miRNAs 的表達顯著下降，并推測這些異常表達的miRNAs 可能與結腸癌的發病機制有關。而國內學者吳一峰等［6］最新研究發現miR-192在結腸癌組織中的表達顯著降低，且與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期相關。

Nrf2/HO-1 是機體重要的抗氧化信號通路，廣泛存在于機體的各個組織器官中。核因子E2（nu‐clear factor E2 related factor，Nrf2）是體內抗氧化調節的重要蛋白，在細胞受到氧化刺激時，Nrf2迅速從位于胞漿的復合物中解離出來，活化后進入細胞核，進而激活下游基因如血紅素加氧酶（heme oxy‐genase 1，HO-1）的轉錄，促進抗氧化劑的表達以增強細胞的抗氧化能力，抑制活性氧及炎癥等有害物質的釋放并最終發揮保護細胞功能的作用［7］。最近有研究發現，Nrf2/HO-1 信號通路能夠通過影響巨噬細胞的活化，從而發揮抗炎或抑炎的作用［8］。而巨噬細胞作為腸黏膜免疫環境中含量豐富的細胞，在UC 的發展過程中具有重要地位［2］。最近在肺炎相關的小鼠模型中發現，miR-192 能夠通過影響巨噬細胞的功能成為肺炎治療新型靶點［9］。鑒于以上機制，本課題旨在探討miR-192在UC 中表達及其對疾病進展的作用，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6~8周SPF級健康雄性C57BL/6小鼠40 只，體重19~23 g，購于北京維通利華生物公司，飼養于室溫22~28℃，濕度為55%的SPF 級清潔動物房，自由攝食、水，12 h 晝夜周期。本實驗均按照實驗動物管理條例進行，并獲得本院動物護理和使用委員會審核通過。

1.1.2 細胞系及主要試劑 293T 細胞購自中國科學院上海細胞庫；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國Biosharp 公司）；DMEM/HG（美國 Hyclone 公司）；胎牛血清 FBS（杭州四季青生物公司）；Trizol、Lipo‐fectamine2000、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen 公司）；逆轉錄與實時定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶公司）；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒、HRP 標記山羊抗兔二抗（廣州晶彩生物公司）；丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成公司）；ECL 發光試劑盒（美國Thermo 公司）；GFP 標記的過表達miR-192 慢病毒載體及慢病毒空載體（上海吉凱生物公司）；pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的熒光素酶報告基因質粒、miR-192 mimic 及mimic-NC序列（上海吉瑪）；熒光酶檢測試劑盒（Pro‐mega 公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α 酶聯免疫（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物公司）；抗小鼠F4/80-APC、抗小鼠CD86-FITC、抗小鼠CD206-PE/Cy5.5（美國BD公司）；兔抗Lamin A、HO-1、Nrf2、β-actin 抗體（美國Bioworld 公司）；實時熒光定量PCR 引物（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 40 只C57BL/6 小鼠按隨機數字表法分為4組，正常對照組（Control組）、DSS 誘導的UC 模型組（DSS 組）、過表達miR-192 慢病毒組（miR-192 組）、慢病毒對照組（Negative con‐trol組，即NC 組），每組10只。實驗小鼠適應性飼養1 周后，于造模前24 h 禁食不禁水。參考相關文獻［10］制作UC 模型，簡述如下：實驗前對小鼠禁食不禁水24 h后，使用4%的水合氯醛經腹麻醉（0.1 ml/10 g），miR-192組及NC組小鼠分別經肛門輕柔緩慢的注射50 μl（1×109TU/ml）對應的慢病毒液進入腸內，注射部位距肛門約 6 cm 處，Control 組與 DSS 組小鼠注射等量的生理鹽水。注射完畢后將小鼠倒立放置，并注意保暖，直至小鼠蘇醒并正常進食。除Control 組以外的各組小鼠2.5%的DSS 作為飲用水連續飼養7 d，Control組小鼠以普通飲用水作為對照。實驗開始后每天記錄每只小鼠的體重、糞便性狀及便血情況，參考文獻［10-11］將小鼠的上述指標的評分總和用以評估小鼠的炎癥活動指數（disease activity index，DAI），其中體重變化評分為：0 分=無下降，1分=下降<5%，2分=下降5%~10%，3分=下降11%~15%，4 分=體重下降>15%；糞便性狀評分為：0 分=糞便正常，2 分=糞便松散，4 分=水樣稀便；便血情況評分為：0 分=無血便，2 分=輕度血便，4 分=大量出血。第8 天脫臼后處死各組小鼠，收集各組小鼠的新鮮結腸組織部分用于流式細胞術，其余部分保存于-80℃冰箱以備后續使用。

1.2.2 HE 染色觀察小鼠結腸組織病理變化 取各組小鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中24 h后，進行常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切片后應用HE 試劑盒進行染色，每只小鼠隨機選取3 張切片，光鏡下觀察其組織學變化。

1.2.3 ELISA 實驗檢測結腸黏膜組織中炎癥因子表達水平 刮取各組小鼠結腸黏膜組織后進行勻漿，按照 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 的 ELISA 試劑盒使用方法檢測各組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10表達水平。上述實驗單獨重復3次。

1.2.4 結腸組織中SOD及MDA活性檢測 取各組小鼠適量結腸組織進行勻漿，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀測定結腸組織中SOD及MDA水平。上述實驗單獨重復3次。

1.2.5 分離結腸固有層單核巨噬細胞（lamina pro‐pria mononuclear cells，LPMCs） 參考文獻［12］進行分離各組小鼠LPMCs，簡述如下：將小鼠結腸組織置于含 5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT 的 HBSS溶液中，37℃振蕩消化20 min，室溫下1 000 r/min離心5 min，取下層沉淀再次重復上述消化步驟以充分去除腸上皮細胞。100 μm 的濾網過濾上述組織液，取未過濾出的組織置于含0.05%膠原酶D、0.05% DNaseⅠ與 0.3%Diapase Ⅱ的 PBS 溶液中，37℃振蕩消化1 h。40 μm 的濾網過濾上述組織液，1 500/rmin離心10 min，取下層細胞重懸于4 ml PBS溶液中，并緩慢加入等體積的Ficoll 溶液表面上，并使其形成界面。20℃下2 400/rmin 離心20 min，下層細胞沉淀即為所需LPMCs。

1.2.6 流式細胞術檢測LPMCs 中巨噬細胞極化 取各組小鼠的LPMCs 進行流式細胞儀檢測，其中M1 型巨噬細胞使用 F4/80-APC 與 CD86-FITC 進行標記，M2 型巨噬細胞使用F4/80-APC 與CD206-PE/Cy5.5 進行標記。流式步驟簡述如下：用PBS 將細胞密度調整至 1×105個/ml，取 2 ml 至流式管中，800/rmin 離心 5 min，棄上清后加入 100 μl 的 PBS重懸細胞，依次加入F4/80-PE、CD16/32-PerCP/Cy5.5、CD206-Alexa 647，于 4℃ 避光孵育30 min 后加入 2 ml PBS 洗滌細胞，800/rmin 離心 10 min ，棄上清，再加入 0.2 ml PBS 重懸細胞，0.22 μm 濾膜過濾后上機進行檢測分析。上述實驗單獨重復3次。

1.2.7 細胞培養及雙熒光素酶報告基因檢測 將293T細胞常規復蘇后用含有10%FBS與1%青鏈霉素的DMEM/HG 培養基置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養，待細胞生長融合至80%時用0.25%的胰酶進行消化傳代。應用miRNA 靶基因在線預測網站TargetScan 對miR-192 作用的靶基因進行預測，篩選HO-1 作為其可能的靶分子。將處于對數生長期的293T細胞常規消化后接種于24孔細胞培養板中，調整細胞密度至2×105個/孔，并置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。轉染前3 h將DMEM/HG培養基更換為 Opti-MEM 培養基，根據 Lipofectamine 2000 說明書將 pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的熒光素酶基因報告質粒及miR-192 mimic 及mimic-NC分別轉入293T細胞中，并將細胞分為pmirGLO-HO-1-WT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-WT+mimic-NC、pmirGLO-HO-1-MUT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-MUT+mimic-NC，每組設5 個復孔，于37℃、5%CO2培養箱培養6 h后換為含10%FBS的DMEM/HG 常規培養液。轉染48 h 后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，檢測HO-1 啟動子的熒光強度。上述實驗單獨重復3次。

1.2.8 實時熒光定量PCR（RT-PCR） 將小鼠結腸組織組織置于液氮中研磨為組織勻漿后按照Trizol法提取組織中總RNA，分光光度計檢測濃度與純度后，根據逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA，再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量，RT-PCR 反應條件為：95℃（30 s）預變性后，變性95℃（7 s），退火60℃（30 s），72℃（15 s），40 個循環周期。RT-PCR 引物序列為：miR-192-F：5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'，miR-192-R：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6-F：5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3'，U6-R：5'-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3'。以 U6 為內參，采用 2-ΔΔCt方法分析miR-192的表達水平。上述實驗單獨重復3次。

1.2.9 Western blot 檢測結腸相關蛋白表達 取適量結腸組織加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上研磨后離心提取總蛋白。BCA 法進行蛋白定量，按照1∶4 向上清液中加入5×蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取50 μg 的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，分別加入 Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗，4℃ 搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，以 TBST 溶液清洗 3 次，5 min/次。最后均勻滴加ECL 發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin 的比值作為其相對含量。上述實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0 和GraphPad Prism 5.0方法進行統計分析，數據結果用表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett's 或Bonferroni's多重比較進行分析；顯著性檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-192 在各組小鼠結腸組織中的表達 RTPCR 結果顯示，與 Control 組小鼠相比，DSS 組、NC組、miR-192組小鼠的結腸組織中miR-192均顯著下降，而與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結腸組織中的miR-192 表達顯著升高，NC 組無顯著性差異。這表明DSS 能夠誘導小鼠結腸組織中miR-192 表達下調，而在小鼠體內注射過表達miR-192 慢病毒能明顯緩解miR-192下降的趨勢。見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織中miR-192的表達情況Fig.1 Expression of miR-192 in colon tissue of each group of mice

2.2 過表達miR-192 對DSS 誘導的小鼠腸道炎癥影響 采用體重變化、DAI評分及結腸HE染色來評估小鼠腸道炎癥，結果顯示，從第4 天開始，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的體重較 Control 組顯著減輕（P<0.01），而在第 6、7 天時 miR-192 組小鼠體重下降趨勢較DSS 與NC 組明顯緩解（P<0.05，圖 2A）；DAI 評分顯示，從第 2 天開始，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的DAI 評分較Control 組顯著升高，而在第 5、6、7 天時 miR-192 組小鼠 DAI 分值較 DSS 與 NC組明顯降低（圖2B）。HE 染色結果顯示，Control 組小鼠結腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，絨毛輪廓清晰；DSS 組、NC 組小鼠腸黏膜上皮明顯受損，腺體結構紊亂或消失，黏膜下伴大量炎癥細胞浸潤，隱窩消失；miR-192 組小鼠結腸黏膜基本完整，部分上皮細胞脫落，腺體結構排列欠規則，伴少量炎癥細胞浸潤，腸黏膜損傷程度較DSS組與NC組明顯減輕（圖2C）。

圖2 各組小鼠的體重、DAI變化及結腸病理改變Fig.2 Body weight，DAI changes and colon pathological changes of mice in each group

2.3 過表達miR-192 對DSS 誘導小鼠腸黏膜炎癥因子表達水平的影響 ELISA 結果顯示，與Control組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的結腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 表達均顯著增加；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結腸黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達均明顯減少，而IL-10表達卻顯著增加，NC組無顯著性差異。見圖3。

圖3 各組小鼠的結腸黏膜炎癥因子表達水平Fig.3 Expression levels of colonic mucosa inflammatory factors in each group of mice

2.4 過表達miR-192對小鼠結腸組織MDA、SOD表達水平的影響 MDA、SOD 活性檢測結果顯示，與Control 組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的結腸組織中MDA水平顯著升高，而SOD的活性明顯降低；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結腸組織中MDA 水平明顯降低，SOD 的活性顯著增加，NC 組無顯著性差異。見圖4。

圖4 各組小鼠結腸組織MDA、SOD的表達水平Fig.4 Expression levels of MDA and SOD in colon tissue of mice in each group

2.5 過表達miR-192 對腸道單核巨噬細胞極化的影響 流式細胞術結果表明，與Control 組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠 LPMCs 中 M1 型巨噬細胞所占比例顯著增加，且DSS 組、NC 組小鼠LPMCs中M2型巨噬細胞明顯減少，而miR-192組小鼠LPMCs 中M2 型巨噬細胞無明顯變化；與DSS 組相比，miR-192組小鼠LPMCs中M1型巨噬細胞所占比例明顯減少，但M2型巨噬細胞卻顯著增加，NC組無顯著性差異。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測小鼠體內過表達miR-192后對巨噬細胞極化的影響Fig.5 Flow cytometric detection of effect of overexpres?sion of miR-192 on polarization of macrophages in mice

2.6 miR-192 靶向抑制 HO-1 的表達 miRNA 靶基因在線預測網站TargetScan 預測結果表明HO-1 基因的3'-UTR 存在能與miR-192 的結合位點，這提示HO-1 可能為miR-192 的目標靶基因。利用雙熒光素酶基因報告實驗進行驗證，結果顯示與轉染mim‐ic-NC+HO-1-WT 的293T 細胞相比，轉染miR-192 mimic+HO-1-WT 的細胞熒光素酶活性顯著降低，而轉染mimic-NC+HO-1-MUT 及miR-192 mimic+HO-1-MUT 的細胞熒光素酶活性無顯著性差異，這證實HO-1 是miR-192 的目標靶基因，且其表達能夠被miR-192所抑制。見圖6。

圖6 miR-192靶向調控HO-1表達Fig.6 miR-192 targets and regulates HO-1 expression

2.7 過表達 miR-192 對 LPMCs 中 Nrf-2/HO-1 信號通路表達的影響 Western blot 實驗結果顯示，與Control 組小鼠相比，DSS 組、miR-192 組、NC 組小鼠LPMCs 中，Nrf-2、HO-1 蛋白表達均顯著增加；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠 LPMCs 中 Nrf-2、HO-1蛋白表達明顯增加，NC組無顯著性差異。見圖7。

圖7 過表達miR-192 對LPMCs 中Nrf-2/HO-1 信號通路表達Fig.7 Overexpression of miR-192 affects expression of Nrf-2/HO-1 signaling pathways in LPMCs

3 討論

UC作為炎癥性腸病的一種，其具體發病機制未完全清楚，而近年來，我國UC 的發病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量。目前臨床針對UC現有治療方法的效果均不理想，UC的治療依賴于對其機制的研究。

異常的先天性或適應性免疫反應促進UC 的進展，其中包括促炎因子（如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12等）的表達水平升高及抑炎因子（如IL-10）的表達水平降低［13-14］。此外，腸黏膜組織氧化-抗氧化系統的失衡也是導致UC 發生的重要原因。在正常情況下，機體內的活性氧（reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、超氧陰離子、NO 等）受超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶和一些抗氧化分子的精確調控，使活性氧的生成與清除維持在動態平衡的狀態下［15］。而當機體受到有害刺激時ROS 濃度急劇升高并超出抗氧化系統的調節代償能力時就會導致氧化應激，刺激細胞生成多種傷害性物質作用于腸上皮細胞，引起上皮細胞的功能障礙，損傷腸黏膜屏障［16-17］。

miRNAs 作為長度約為20~25 個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，近年來在腫瘤、心腦血管、內分泌代謝及病毒感染等多種疾病領域的作用已受到越來越多學者的關注［18］。而在炎癥性腸病中，國內外多數學者發現UC 患者的腸黏膜組織存在異常表達的miRNAs譜，其中miR-192在多個研究的結果中均表現為異常降低的現象［4-5，19］。miR-192由13號染色體長臂所編碼，研究發現其在不同的器官或組織中發揮著不同的作用，如在腎臟中，miR-192 能夠調控TGF-β/Smad3 通路參與調控腎臟的纖維化［20］。在肺癌中，miR-192-5p 能夠在姜黃素的作用下上調其表達，通過PI3K/AKT 信號通路抑制肺癌細胞的增殖并誘導其發生凋亡［21］。在本研究中通過DSS建立小鼠UC 模型發現，miR-192 在UC 小鼠的結腸黏膜組織中的表達異常降低，這與既往的研究結果相同。同時，通過慢病毒過表達小鼠腸道黏膜組織中miR-192 發現，miR-192 能夠顯著改善 UC 小鼠的體重下降、黏液膿血便等癥狀。結腸黏膜的HE 染色也證實，過表達miR-192能夠減輕UC 小鼠結腸組織的病理損傷。此外，檢測過表達miR-192對UC 小鼠結腸組織炎癥因子的表達及氧化應激的影響，結果miR-192 能夠顯著降低結腸黏膜組織對促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，上調抑炎因子IL-10的表達，同時增加 SOD 活性，減少 MDA 的產生。SOD 作為機體重要的抗氧化物酶，能夠清除組織內過度釋放的氧自由基。腸道黏膜組織的SOD 抗氧化活性功能減低可導致局部的自由基清除能力受限，加重UC病情的進展。而MDA則是由ROS誘發而產生不飽和脂肪酸，其常被作為氧化應激對組織損傷的標志［22］。為進一步明確miR-192發揮上述保護性作用的相關機制，應用生物信息學進行深入探究，miR‐NA靶基因預測結果表明，HO-1存在能夠與miR-192結合的序列，隨后雙熒光素酶基因報告實驗驗證了兩者的靶向調控關系。

HO-1是近年來發現的一種應激誘導蛋白，可由ROS 和炎癥信號誘導產生，產生細胞內源性保護作用［23］。因而，HO-1的表達被認為是對抗炎癥反應和氧化損傷的適應性細胞反應［24］。在體內HO-1 與Nrf2 形成Nrf2/HO-1 信號通路，通過調控體內的抗氧化應激反應。而近年來有研究發現Nrf2/HO-1能夠調控巨噬細胞的分化參與多種病理生理過程［25］。巨噬細胞作為腸道黏膜的固有免疫細胞，能通過多種炎癥因子調控結腸炎，特別是急性期結腸的進展。既往研究發現巨噬細胞在不同的刺激下可分為M1 型與M2 型巨噬細胞，而這兩種類型在UC 的發生發展中起著相反的作用［26］。M1 型巨噬細胞主要通過 INF-γ、TNF-α 等信號誘導激活，分泌大量IL-1β、TNF-α 等促炎因子，損傷黏膜結構及功能，加劇UC 的進展。而M2 型巨噬細胞又稱抗炎癥巨噬細胞，其主要通過IL-4、IL-10 等誘導激活，穩定高水平表達 IL-10 以促進黏膜損傷的修復［2，27］。最近有研究證實，HO-1 通過促進IL-10 的表達激活巨噬細胞的 M2 型極化，并抑制促炎因子 IL-6、TNF-α 等表達［28-29］。本研究發現在UC 小鼠體內過表達miR-192同樣能夠通過Nrf2/HO-1信號通路調控結腸黏膜巨噬細胞向M2 型極化，這可能是miR-192 在UC 小鼠體內發揮上述腸黏膜保護功能的作用機制。

綜上，本研究發現在DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型中miR-192 可靶向調控Nrf2/HO-1 信號通路的表達，促進腸黏膜巨噬細胞M1 型極化，發揮抗炎、抗氧化作用，改善結腸炎癥狀從而發揮保護作用，為結腸炎的治療提供了新的策略與方向。