正清風痛寧緩釋片通過調控HOTAIRM1/miR-137 軸影響人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的機制研究①

盛雪鶴 解雪峰 （安徽醫科大學藥學院，合肥230032）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以滑膜炎癥和關節破壞為特征的自身免疫性疾病，其病理特點主要表現為滑膜細胞“腫瘤樣”增殖和炎癥［1-2］。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synovio‐cytes，FLS）是關節滑膜細胞中的主要效應細胞，在RA 的滑膜炎癥和關節破壞中起重要作用，其凋亡不足與RA 滑膜增生密切相關［3］。正清風痛寧緩釋片是臨床常用的治療RA 的藥物，療效顯著，但其治療RA 的具體機制尚未明確［4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小 RNA（mi‐croRNA，miRNA）是兩類小分子非編碼RNA，參與調控細胞生長、凋亡和遷移等生物學行為，是免疫性疾病、腫瘤等疾病治療的潛在靶點［5-6］。研究還表明，lncRNA 與miRNA 存在相互作用，兩者共同參與疾病的發生發展［7］。HOXA 轉錄本反義RNA1（HO‐TAIRM1）是一種lncRNA，有報道稱，其在RA患者外周血淋巴細胞中表達升高，但還未見其影響FLS 凋亡的相關報道［8］。生物信息學軟件預測顯示，HO‐TAIRM1 與miR-137 的核苷酸序列存在連續結合位點，miR-137 可能是HOTAIRM1 的靶基因。研究顯示，miR-137 在 FLS 中呈低表達，過表達 miR-137 可降低FLS 的增殖、遷移和侵襲及炎癥細胞因子的表達，可能是骨關節炎的治療靶點［9］。因此，本研究以HOTAIRM1/miR-137 軸為切入點，觀察正清風痛寧緩釋片對FLS 凋亡的影響，初步探討其治療RA 的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM 培養基、細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、胰蛋白酶、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，Lipofectami‐neTM2000 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，PCR 引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，HOTAIRM1的小干擾RNA（si-HO‐TAIRM1）及亂序無意義陰性序列（si-NC）、HO‐TAIRM1 過表達載體（pcDNA-HOTAIRM1）及陰性對照空載體（pcDNA）、miR-137 抑制劑（anti-miR-137）及抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成，兔抗人半胱天冬酶-3（Caspase-3）單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，IL-1α和IL-6試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 分離與培養FLS 參照文獻方法分離和培養FLS［10］。取于本院關節外科行膝關節置換的RA患者滑膜組織，迅速采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，分離滑膜，去除多余脂肪和纖維組織。使用眼科剪將滑膜組織剪至2~3 mm3，加入含10 % 1 mg/ml Ⅱ型膠原酶的高糖型DMEM 培養基，置于37℃培養箱中消化3~4 h，消化后加入含10% FBS 的DMEM 培養基（完全培養基）終止消化，1 500/rmin 離心 10 min，離心半徑18 cm。吸棄上清，加入完全培養基，接種至25 cm2培養瓶中，37℃培養箱培養。培養5 d 后，第1 次換液，此后每2~3 d 更換1 次培養基。當細胞融合至80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養。

1.2.2 FLS 分組處理 FLS 分為對照組：細胞正常培養；實驗組：分別用含 0.05、0.1、0.2 mg/ml 正清風痛寧緩釋片的完全培養基培養24 h［11］。對數增殖期的FLS以1×105個/孔接種于6孔板中，當細胞融合至60%時，分別將si-HOTAIRM1、si-NC、pcDNA-HO‐TAIRM1、pcDNA、anti-miR-137、anti-miR-NC 轉染至FLS，具體轉染操作參照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書，轉染24 h 后，收集細胞備用。轉染si-HO‐TAIRM1、si-NC 的 FLS 培養 24 h，分別記為 si-HO‐TAIRM1 組 和 si-NC 組 。 轉 染 pcDNA-HOTAIRM1、pcDNA、anti-miR-137、anti-miR-NC 的 FLS 均 用 含0.2 mg/ml 正清風痛寧緩釋片的完全培養基培養24 h，分別記為 0.2 mg/ml+pcDNA-HOTAIRM1 組、0.2 mg/ml+pcDNA 組、0.2 mg/ml+anti-miR-137 組、0.2 mg/ml+anti-miR-NC組。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞存活率 各組細胞以5×103個接種于 96 孔板中，每組 3 個復孔。按照1.2.2 分組培養后，每孔加入 10 μl CCK8 溶液，培養箱繼續孵育4 h，于酶標儀450 nm 處測定吸光度值（absorbance，A）。實驗重復3 次。細胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞以2.5×104個/孔接種于24 孔板中，每組3 個復孔。按照1.2.2 分組培養后，胰蛋白酶消化。取1.0×106個細胞，PBS 清洗 2 次，1 500/rmin 離心 5 min，離心半徑18 cm。吸棄上清，加入500 μl 結合緩沖液，混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞凋亡率（%）=（早期凋亡數+晚期凋亡數）/總細胞數×100%。

1.2.5 Western blot 法 檢 測 Caspase-3 蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，濕轉至聚偏二氟乙烯膜。轉膜后，于5%脫脂牛奶中封閉2 h。然后于Caspase-3 抗體孵育中，4℃孵育過夜。洗膜后，于二抗孵育液中，37℃孵育1 h。洗膜后，滴加ELC 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。以GAPDH 為內參，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 ELISA檢測細胞中IL-1α和IL-6表達水平 各組細胞以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組3個復孔。按照1.2.2分組培養后，胰蛋白酶消化，收集細胞。加入細胞裂解液充分裂解細胞，3 500/rmin離心5 min，離心半徑18 cm。分別參照IL-1α和IL-6試劑盒檢測上清中IL-1α、IL-6水平。

1.2.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測細胞中HOTAIRM1 和 miR-137 表達水平 Trizol 試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度后進行定量。使用逆轉錄試劑盒將RNA 合成為cDNA。以cDNA 為模板，進行擴增。擴增程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共 35 個循環。HO‐TAIRM1上游5'-TGCGCAGGCCGTCAGCTG-3'，下游5'-CGTACGCCCGCAAAGTCGCG-3'；GAPDH上游5'-GCTGACAGCTAGCGCTGACG-3'，下游 5'-GCGCGAAAGCTGATTTGCAACG-3'；miR-137上游5'-GCTCGACACGTGCGTCTCT-3'，下游 5'-CTGACTGTGAAC‐GTGAATC-3'；U6 上游 5'-CGTGTAAGCTGATCTCC‐GAC-3'，下游 5'-CGAATCAAGCTAGGCCACGTG-3'。HOTAIRM1 以 GAPDH 為內參 ，miR-137 以 U6 為 內參，2-ΔΔCt法計算 HOTAIRM1 和 miR-137 的相對表達水平。

1.2.8 HOTAIRM1 和 miR-137 靶向關系驗證 PCR 擴增含miR-137結合位點的HOTAIRM1的核苷酸序列，克隆至pYr-MirTarget載體，構建HOTAIRM1野生型熒光素酶報告質粒（HOTAIRM1-WT）。利用基因突變技術將結合位點突變，克隆至pYr-MirTar‐get 載體，構建HOTAIRM1 突變型熒光素酶報告質粒（HOTAIRM1-MUT）。分別將HOTAIRM1-WT、HOTAIRM1-MUT 與 miR-137 mimic 或 miR-NC 共 轉 染 至FLS。轉染24 h 后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。同時轉染 si-HOTAIRM1、si-NC、pcDNA-HOTAIRM1、pc-DNA 后的FLS 以2.5×104個/孔接種于24 孔板中，每組3 個復孔。培養24 h 后，胰蛋白酶消化，收集細胞，RT-qPCR 法檢測細胞中miR-137表達水平，方法同1.2.7。

1.3 統計學分析 利用SPSS22.0軟件分析實驗數據。計量資料以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正清風痛寧緩釋片對FLS 存活率及凋亡的影響 與對照組比較，不同劑量正清風痛寧緩釋片組細胞存活率顯著降低（P<0.05），凋亡率和Caspase-3蛋白水平顯著升高（P<0.05）。見圖1和表1。

表1 正清風痛寧緩釋片對FLS 存活率及凋亡的影響（，n=9）Tab.1 Effect of Zhengqing Fengtongning sustained re?lease tablet on survival rate and apoptosis of FLS（，n=9）

表1 正清風痛寧緩釋片對FLS 存活率及凋亡的影響（，n=9）Tab.1 Effect of Zhengqing Fengtongning sustained re?lease tablet on survival rate and apoptosis of FLS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.84±1.01 13.37±1.341）16.42±1.581）19.16±1.831）81.335<0.001 Groups Con 0.05 mg/ ml 0.1 mg/ ml 0.2 mg/ ml F P Caspase-3 0.28±0.03 0.37±0.031）0.52±0.041）0.63±0.051）147.661<0.001 Survival rate（%）100.03±10.01 89.59±8.671）77.15±7.311）56.61±5.351）48.737<0.001

圖1 正清風痛寧緩釋片對FLS凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Zhengqingfengtongning sustained release tablets on apoptosis and Caspase-3 protein expres?sion of FLS

2.2 正清風痛寧緩釋片對FLS中HOTAIRM1、miR-137 及炎癥因子表達的影響 與對照組比較，不同劑量正清風痛寧緩釋片組細胞HOTAIRM1、IL-1α和 IL-6 表達水平顯著降低（P<0.05），miR-137 表達水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 正清風痛寧緩釋片對FLS 中HOTAIRM1、miR-137及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.2 Effects of Zhengqing Fengtongning sustained re?lease tablets on expression of HOTAIRM1，miR-137 and inflammatory factors in FLS（，n=9）

表2 正清風痛寧緩釋片對FLS 中HOTAIRM1、miR-137及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.2 Effects of Zhengqing Fengtongning sustained re?lease tablets on expression of HOTAIRM1，miR-137 and inflammatory factors in FLS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

IL-6（pg/ ml）98.28±7.15 74.66±6.691）59.93±5.641）50.10±5.111）102.732<0.001 Groups Con 0.05 mg/ ml 0.1 mg/ ml 0.2 mg/ ml F P HOTAIRM1 1.01±0.07 0.82±0.061）0.68±0.061）0.47±0.051）127.973<0.001 miR-137 0.99±0.09 1.21±0.101）1.37±0.111）1.55±0.121）45.740<0.001 IL-1α（pg/ ml）85.14±6.23 68.03±6.021）45.21±5.071）39.26±4.161）136.604<0.001

2.3 抑制HOTAIRM1 對FLS 存活率、凋亡及炎癥因子表達的影響 與si-NC 組比較，si-HOTAIRM1組細胞中 HOTAIRM1、IL-1α 和 IL-6 表達水平、細胞存活率顯著降低（P<0.05），細胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖2 和表3。

表3 抑制HOTAIRM1對FLS存活率、凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS survival，apoptosis and expression of inflammatory factors（，n=9）

表3 抑制HOTAIRM1對FLS存活率、凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS survival，apoptosis and expression of inflammatory factors（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.69±0.98 17.15±1.311）15.513<0.001 Groups si-NC si-HOTAIRM1 t P HOTAIRM1 1.00±0.06 0.34±0.041）27.458<0.001 Caspase-3 0.27±0.03 0.51±0.041）14.400<0.001 IL-1α（pg/ ml）85.11±6.18 42.34±4.571）16.694<0.001 IL-6（pg/ ml）97.23±7.04 55.57±5.631）13.865<0.001 Survival rate（%）100.00±10.00 64.21±6.691）8.924<0.001

圖2 抑制HOTAIRM1 對FLS 凋亡及Caspase-3 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS apoptosis and Caspase-3 protein expression

2.4 HOTAIRM1 靶向調控miR-137 生物信息學軟件預測顯示，HOTAIRM1 與miR-137 的核苷酸序列存在結合位點，見圖3。與共轉染WT-HOTAIRM1的miR-NC 組比較，miR-137 組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而與共轉染 MUT-HOTAIRM1 的miRNC 組比較，miR-137 組熒光素酶活性無顯著變化（P>0.05），見表 4。pcDNA3.1-HOTAIRM1 組細胞中 miR-137 表達水平（0.33±0.04）顯著低于 pc-DNA3.1 組（1.01±0.06）（P<0.05），si-HOTAIRM1 組細胞中miR-137 表達水平（1.69±0.09）顯著高于si-NC組（0.98±0.06，P<0.05）。

表4 雙熒光素酶報告實驗結果（，n=9）Tab.4 Double fluorescein report experiment results（，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗結果（，n=9）Tab.4 Double fluorescein report experiment results（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-HOTAIRM1 0.97±0.09 0.95±0.09 0.471 0.644 Groups miR-NC miR-137 t P WT-HOTAIRM1 0.95±0.09 0.24±0.021）23.103<0.001

圖3 HOTAIRM1與miR-137的結合位點Fig.3 Binding site of HOTAIRM1 and miR-137

2.5 過表達HOTAIRM1 減弱正清風痛寧緩釋片對FLS 存活、凋亡及炎癥因子表達的影響 與實驗3+pcDNA3.1 組比較，實驗3+pcDNA3.1-HOTAIRM1組細胞中 HOTAIRM1、IL-1α 和 IL-6 表達水平、細胞存活率顯著升高（P<0.05），細胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。見圖4和表5。

表5 過表達HOTAIRM1能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS存活率及凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.5 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on survival rate，apoptosis and inflammatory factor expression of FLS（，n=9）

表5 過表達HOTAIRM1能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS存活率及凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.5 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on survival rate，apoptosis and inflammatory factor expression of FLS（，n=9）

Note：Compared with experimental 3+pcDNA3.1 group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）19.10±1.41 11.03±1.111）13.491<0.001 Groups Experimental 3+pcDNA3.1 Experimental 3+pcDNA3.1-HOTAIRM1 t P HOTAIRM1 0.99±0.10 1.88±0.151）14.811<0.001 Caspase-3 0.62±0.04 0.35±0.031）16.200<0.001 IL-1α（pg/ ml）39.34±4.11 72.29±6.631）12.672<0.001 IL-6（pg/ ml）50.14±5.16 81.46±7.031）10.775<0.001 Survival rate（%）56.64±5.61 92.15±8.131）10.785<0.001

圖4 過表達HOTAIRM1減弱正清風痛寧緩釋片對FLS 凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.4 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS apoptosis and expression of Caspase-3 protein

2.6 抑制miR-137 能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS 存活率及凋亡及炎癥因子表達的影響 與實驗3+anti-miR-NC 組比較，實驗 3+anti-miR-137 組細胞存活率、IL-1α 和IL-6 表達水平顯著升高（P<0.05），miR-137、細胞凋亡率和Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。見圖5和表6。

圖5 抑制miR-137 能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS 凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.5 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablet on FLS apop?tosis and expression of Caspase-3 protein

表6 抑制miR-137能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS存活率及凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.6 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS survival rate，apop?tosis and inflammatory factor expression（，n=9）

表6 抑制miR-137能減弱正清風痛寧緩釋片對FLS存活率及凋亡及炎癥因子表達的影響（，n=9）Tab.6 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS survival rate，apop?tosis and inflammatory factor expression（，n=9）

Note：Compared with experimental 3+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）19.16±1.44 9.93±1.101）15.281<0.001 Experimental 3+anti-miR-NC Experimental 3+anti-miR-137 t P 1.01±0.07 0.41±0.051）20.925<0.001 0.60±0.04 0.33±0.031）16.200<0.001 39.38±4.14 77.73±5.581）18.691<0.001 50.26±5.17 86.14±6.621）12.815<0.001 56.37±5.63 94.06±7.081）12.500<0.001 GroupsmiR-137Caspase-3IL-1α（pg/ ml）IL-6（pg/ ml）Survival rate（%）

3 討論

正清風痛寧緩釋片是以傳統治療風濕性疾病的中藥青風藤的主要活性成分青藤堿為主要原料，經現代工藝精制而成的純中藥制劑，是治療RA 的常用藥物。但目前，正清風痛寧緩釋片治療RA 的作用機制還未明確。RA 的發生發展與滑膜增殖密切相關，FLS 的過度增殖與凋亡不足以及炎癥被認為是引起滑膜增生的關鍵因素［12］。本研究顯示，正清風痛寧緩釋片可能通過促進Caspase-3 蛋白表達誘導FLS凋亡，降低FLS細胞中IL-1α 和IL-6表達減輕炎癥反應達到治療RA 的效果，但其具體的分子機制還有待探討。

HOTAIRM1 是近年來新發現的一種lncRNA。研究顯示，HOTAIRM1 高表達的神經膠質瘤患者預后較差，抑制HOTAIRM1 表達可降低神經膠質瘤的惡性行為，并增加腫瘤對治療藥物替莫唑胺的敏感性［13］。HOTAIRM1 在胰腺導管腺癌組織和細胞中表達升高，抑制HOTAIRM1 通過誘導G0/G1期細胞周期停滯，促進細胞凋亡抑制胰腺導管腺癌細胞增殖和遷移增殖，可能是胰腺導管腺癌新診斷和治療靶標［14］。但目前，HOTAIRM1對FLS的影響還未知。本研究顯示，抑制HOTAIRM1 表達可降低FLS 存活率及IL-1α、IL-6 表達降低，誘導細胞凋亡率及Cas‐pase-3 蛋白表達，提示HOTAIRM1 可能通過促進Caspase-3 蛋白表達誘導FLS 凋亡及降低炎癥反應參與RA 發展進程，是RA 的治療靶點。本研究還顯示，正清風痛寧緩釋片可降低FLS 中HOTAIRM1 表達，而過表達HOTAIRM1 降低了正清風痛寧緩釋片對FLS 凋亡的促進作用及炎癥因子IL-1α 和IL-6 表達的抑制作用，提示正清風痛寧緩釋片通過抑制HOTAIRM1表達發揮治療RA的作用。

越來越多的研究表明，lncRNA 可與miRNA 的位點結合，進而調控miRNA 表達影響疾病的發生發展。如lncRNA ZFPM2-AS1在神經母細胞瘤（RB）組織和細胞系中表達明顯升高，其充當miR-515 的競爭內源RNA，促進HOXA1 表達，并激活Wnt/βcatenin 信號通路，促進 RB 發展［15］。為了進一步探討正清風痛寧緩釋片抑制HOTAIRM1表達影響FLS凋亡及炎癥因子表達的分子機制，通過生物信息學軟件預測顯示，HOTAIRM1 與miR-137 的核苷酸序列存在結合位點，HOTAIRM 可能調控miR-137 表達來影響RA 發生發展。本研究雙熒光素酶活性檢測顯示，miR-137 mimics 可降低 HOTAIRM1 野生型的熒光素酶活性，而對其突變型的熒光素酶活性無顯著影響，說明HOTAIRM1 可與miR-137 的核苷酸序列結合。且上調或下調FLS 中HOTAIRM1 表達后，miR-137 表達下調或上調，證實了HOTAIRM1 在FLS 中靶向負調控miR-137 表達。本研究還顯示，正清風痛寧緩釋片可促進FLS 表達miR-137，而抑制miR-137 表達可降低正清風痛寧緩釋片對FLS 凋亡的促進作用及炎性因子IL-1α 和IL-6 表達的抑制作用，這提示正清風痛寧緩釋片通過抑制HO‐TAIRM1 表達，進而上調 miR-137 表達誘導 FLS 凋亡及降低炎癥反應，發揮治療RA的作用。

綜上所述，正清風痛寧緩釋片可能通過調控HOTAIRM1/miR-137軸誘導FLS凋亡及降低炎癥反應，從而發揮治療RA 的作用。但本研究僅在細胞層面探討了正清風痛寧緩釋片對FLS凋亡和炎癥的影響及作用機制，接下來將通過建立動物模型進一步驗證和探討正清風痛寧緩釋片治療RA 的作用機制。