ARA55過表達激活內源性線粒體凋亡通路誘導CNE2鼻咽癌細胞凋亡①

崔兆磊 辛小琴 陳 燕 （福建醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科生物化學分子生物學研究室，福州350014）

鼻咽癌是一種發生于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，以發病地域性強，惡性度高，易轉移等為特點［1］。由于缺乏靈敏度高的標志物，很多患者失去早期診斷的機會。雄激素受體相關蛋白55（androgen receptor coactivator 55 kD protein，ARA55）是雄激素受體輔助因子（androgen receptor coactivator，ARA）的重要成員之一，其表達主要見于人前列腺基質細胞，可作為一種輔助激活因子通過介導蛋白間的相互作用或磷酸化水平等調節雄激素受體的轉錄活性［2］。目前關于ARA55 在惡性腫瘤中發揮怎樣的生物學功能研究者尚未達成一致。研究顯示，ARA55 可能是一種抑癌基因，因其在部分惡性腫瘤包括前列腺癌、胰腺癌以及食管鱗癌等的癌組織表達明顯降低，而在相應的癌旁組織中表達升高［3-5］。然而有研究發現ARA55 在癌細胞發生侵襲轉移時的形態改變及可塑性等過程中發揮重要作用［6］。目前，ARA55 在鼻咽癌的發生與發展中發揮的作用尚不明確。本研究擬探討ARA55基因/蛋白表達上調對CNE2 鼻咽癌生長增殖和侵襲遷移等生物學特性的影響，同時探討相應的分子機制，以期明確ARA55在鼻咽癌發生發展中發揮的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV-ARA55-EGFP 重組質粒為前期構建［7］。RPMI1640 培養基、PBS 緩沖液、雙抗（Hy‐clone 公司）。ZLip2000 轉染試劑盒（北京莊盟）、CCK-8（日本同仁）、Annexin V-PE/7-AAD 凋亡試劑盒（南京凱基）；DNA Ladder 抽提、BCA 法蛋白定量、SDS-PAGE 凝膠和RIPA 蛋白提取等試劑盒、鼠抗人Caspase-3、Cytochrome C 和 β-actin 單克隆抗體等均為碧云天產品。鼠抗人ARA55單克隆抗體、兔抗人Caspase-9 多克隆抗體（Santa Cruz 公司）。兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養條件、質粒轉染 人CNE2 鼻咽癌細胞為本實驗室保存。培養基為RPMI1640（含10%FBS 及1%雙抗），細胞培養于含5%CO2飽和濕度的37℃恒溫箱，每3~5 d 傳代1 次。前期構建的pCMV-ARA55-EGFP 重組質粒經ZLip2000 轉染至CNE2 細胞。實驗設ARA55 過表達組（pCMVARA55-EGFP）、空載體組（mock control）和空白對照組（blank control）。質粒轉染后24~48 h 經熒光顯微鏡觀察是否有EGFP的表達，判斷質粒是否轉染成功。

1.2.2 CCK-8 比色實驗 選用96 孔培養板，每孔接種 5 000 個對數期的 CNE2 細胞，總體積 100 μl，各組細胞置于培養箱中培養。設定時間點，在培養的24 h、48 h、72 h 加入CCK-8 試劑（10 μl/孔），繼續培養2~3 h。檢測時需設置酶標儀雙波長（450 nm和630 nm）模式，在此模式下檢測每孔細胞的OD 值（OD 值的大小與細胞的數量成正比），繪制細胞生長曲線，橫軸為培養時間，縱軸為檢測的OD 值。實驗每組含3個復孔，重復3次。

1.2.3 劃痕修復實驗 實驗于6孔培養板中進行，每孔加 5×105個 CNE2 細胞，培養約 8～12 h，保證細胞單層不重疊，貼壁平鋪，細胞融合率應該接近100%。選用無菌加樣槍的吸頭（200 μl 規格）垂直劃痕（用力盡量均勻，以保證劃痕邊緣整齊），用PBS洗滌，加入不含FBS 的RPMI1640 培養基，細胞培養于含5% CO2飽和濕度的37℃恒溫箱。于培養不同時間點顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 Transwell 小室體外侵襲遷移實驗 侵襲實驗時，按1∶5體積比在無FBS 的RPMI1640培養基中加入Matrigel 膠以檢測細胞的侵襲能力。在冰塊上充分混勻后，每個小室的上腔室各加100 μl（3 個室），37℃孵育4~5 h。在每孔中加入50 000個CNE2細胞，下腔室中加入500 μl 的RPMI1640 培養基（含FBS的濃度為20%）。培養的不同時間點取出小室，用PBS 洗滌2~3 次，滴加濃度為5%的戊二醛固定20 min 以上。用Giemsa 染色液常溫染色5~10 min，顯微鏡統計結果［8］。Transwell 小室遷移實驗中不需用Matrigel膠包被基底膜，其他步驟同侵襲實驗。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 在重組質粒轉染72 h后，用胰酶消化各組細胞，PBS洗滌后離心收集細胞，細胞計數儀調整細胞密度為5×105個/ml；按試劑盒相應步驟加入Binding Buffer、Annexin V-PE染液、7-AAD染液等，盡快于流式細胞儀檢測［9］。

1.2.6 DNA 片段電泳檢測細胞凋亡片段生成情況 收集約1.0×106個細胞，胞重懸于PBS 中，依次加入RNase A，蛋白酶K，裂解液B，無水乙醇等提取基因組DNA，加入洗脫液約100 μl，在12 000/rmin條件下離心1 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，18 V 電泳 4~6 h［10］。

1.2.7 免疫印跡實驗 細胞總蛋白的提取采用RIPA蛋白裂解液，BCA法蛋白定量。配置10%分離膠和5%濃縮膠，電泳分離目的蛋白，110 V 恒壓電轉移至PVDF 膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗的濃度分別為：Bcl-2（1∶1 000），Bax（1∶300），Cy‐tochrome C（1∶500），Caspase-9（1∶200），Cleaved cas‐pase-3（1∶300），β-actin（1∶1 000）。4℃ 孵育過夜。用 TBST 洗 滌 吸 附 蛋 白 的 PVDF 膜 3 次 ，加 入 1∶10 000 TBST稀釋的二抗（HRP標記的羊抗兔或抗鼠抗體），放在搖床室溫環境中繼續孵育1~2 h，加ECL顯色液（A、B 液）后于蛋白成像儀中曝光顯影。βactin 為內參照蛋白，蛋白進行相對定量采用Image J軟件。

2 結果

2.1 pCMV-ARA55-EGFP轉染上調CNE2細胞中外源 性 ARA55 的表 達 CNE2 細 胞轉 染 pCMVARA55-EGFP 重組質粒 24 h 后即可觀察到 EGFP 的表達，熒光主要位于胞質（圖1）。免疫印跡實驗在pCMV-ARA55-EGFP 組細胞中可檢測到分子量約為80 kD的融合蛋白ARA55-EGFP的表達（圖1）。

圖1 CNE2 細胞轉染過表達重組質粒后ARA55-EGFP 融合蛋白的表達Fig.1 Expression of ARA55-EGFP fusion protein in re?combinant plasmids transfected CNE2 cells

2.2 外源性ARA55 表達抑制CNE2 細胞生長增殖 采用CCK-8 比色繪制細胞增殖曲線，結果顯示，隨時間的延長pCMV-ARA55-EGFP 組CNE2 細胞增殖受到抑制，72 h 的 OD 值為 0.540±0.031，而pCMV-C-EGFP 組和空白對照組 72 h 的 OD 分別為0.796±0.024 和 0.861±0.010。 ARA55 過 表 達 組48 h 和 72 h 的 OD 值與 pCMV-C-EGFP 組相比，差異均具有統計學意義（圖2）。

圖2 基于CCK-8實驗繪制的細胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve based on CCK-8 testing

2.3 ARA55 過表達抑制CNE2 細胞的體外遷移能力 劃痕修復實驗顯示（圖3），ARA55表達上調后，pCMV-ARA55-EGFP 組出現遷移的CNE2 細胞數量明顯低于空載體組（P<0.01），說明外源性ARA55可抑制CEN2細胞的體外遷移。

圖3 劃痕修復實驗檢測ARA55 過表達對CNE2 細胞體外遷移能力的影響Fig.3 Effects of ARA55 restoration on CNE2 cell migration assessed using wound healing migration assay

2.4 ARA55 對CNE2 細胞體外侵襲遷移能力的影響 體外侵襲實驗結果可見（圖4），pCMV-ARA55-EGFP 組發生侵襲和遷移的CNE2 細胞數量顯著少于空載體組和空白對照組，說明ARA55過表達可以抑制CNE2細胞的體外侵襲和遷移能力。

圖4 Transwell 小室實驗檢測ARA55 過表達對CNE2 細胞體外侵襲遷移能力的影響Fig.4 Transwell invasion assay assessed effects of ARA55 overexpression on CNE2 cell migration and invasion

2.5 ARA55過表達誘導CNE2細胞凋亡 采用An‐nexin V-PE/7-AAD 雙熒光標記結合FCM 檢測CNE2細胞的凋亡率（早期+晚期凋亡），結果顯示轉染48 h后ARA55 過表達組的細胞總凋亡率可達52.8%，而空載體組凋亡率僅為7.2%（圖5）。DNA 梯狀電泳結果顯示，隨時間延長，ARA55 過表達組“梯狀”DNA 片段化程度越來越明顯。以上結果說明，過表達外源性ARA55可誘導CNE2細胞發生凋亡。

圖5 Annexin V-PE/7-AAD 雙熒光標記結合FCM 及DNA ladder分析細胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis analysis by Annexin V-PE/7-AAD dou?ble staining/FCM and DNA ladder

2.6 免疫印跡檢測凋亡相關蛋白的表達變化 免疫印跡結果顯示，轉染72 h 后，相對于其他兩對照組，ARA55 過表達組 Bcl-2 表達量顯著下調，Cyto‐chrome C、Caspase-9 的剪接體和激活型 Caspase-3 的表達量顯著升高，而各組間Bax 表達量變化差異無統計學意義（圖6）。

圖6 免疫印跡檢測ARA55 過表達后凋亡相關蛋白的表達改變Fig.6 Changes of apoptosis-related proteins in response to ARA55 overexpression detected using immunob?lotting

3 討論

ARA55是最初從TGF-β1誘導的小鼠MC3T3-E1成骨細胞中被鑒定發現的蛋白分子，因此又稱為轉化生長因子 β1 誘導因子 1（transforming growth fac‐tor beta-1-induced transcript 1 protein，TGF-β1I1）［2］。ARA55屬于LIM 蛋白家族，蛋白結構與樁蛋白（pax‐illin）家族高度同源。人類ARA55基因定位在16 號染色體（chr16：31，471，585-31，477，960；GRCh38/hg38），共含11個外顯子，ORF為1 386 bp，編碼的蛋白多肽含有461個氨基酸，分子量為55 kD。本研究將pCMV-ARA55-EGFP 重組質粒轉染到CNE2 細胞后，24 h 即可看到 EGFP 的表達，約 48 h 達到表達高峰，EGFP 的表達陽性率接近60%。因本研究插入的ARA55 全長cDNA 序列與EGFP 共用一個啟動子，故重組質粒表達融合蛋白。本研究經Western blot 進一步確認轉染細胞可表達融合蛋白（ARA55-EGFP），說明重組質粒可在CNE2 細胞中表達外源性ARA55蛋白。

目前，ARA55 在惡性腫瘤中發揮的生物學功能因腫瘤類型的不同而有差異。GULVADY 等［6］研究發現，ARA55 在癌細胞發生侵襲轉移時的形態改變及可塑性調節等過程中發揮重要作用。有報道通過研究大腸癌的裸鼠種植瘤組織細胞和LoVo 大腸癌細胞的超微結構發現，ARA55 的表達在癌細胞的成熟及發展過程中發揮重要作用［11］。QIAN 等［4］發現，胰腺癌患者癌組織中高表達ARA55 蛋白，并且患者的預后受ARA55的表達峰度影響，蛋白表達越高，患者生存時間越短；當下調PCCs 胰腺癌細胞中ARA55 的表達時，可觀察到細胞的生長增殖、侵襲和轉移能力明顯被抑制，細胞發生凋亡。同樣，有研究報道ARA55 在小鼠B16-F1 黑色素瘤細胞中也呈高表達狀態，當采用shRNA 沉默ARA55 表達后，細胞的生長增殖及侵襲遷移均受到不同程度的抑制［12］。在肝細胞癌中也發現，ARA55 的表達與腫瘤的進展密切相關［13］。因此，可推斷ARA55在某些腫瘤中發揮癌基因的作用。

盡管如此，有些研究認為ARA55可能是發揮抑癌基因的作用。有研究顯示ARA55 在大腸癌組織的表達較癌旁組織低［14］。另外，前列腺癌患者癌組織中ARA55的平均表達峰度遠低于癌旁組織；其進一步分析發現，癌組織中ARA55 表達越低的患者，腫瘤的分化程度越高；此外一些培養的前列腺癌細胞系中也發現 ARA55 呈表達下調或沉默狀態［3，15］。本研究在CNE2鼻咽癌細胞中上調外源性ARA55的表達后，發現CNE2 細胞的生長增殖和體外侵襲轉移能力均被不同程度地抑制或阻礙，提示ARA55在鼻咽癌（CNE2 細胞）中發揮抗癌基因的生物學作用。國內有研究在大腸癌LoVo 細胞中上調外源性ARA55 后，也發現細胞發生凋亡［14］，本研究結果與之類似。

本研究進一步探討了ARA55過表達對CEN2細胞凋亡的影響。因重組質粒轉染的CNE2 細胞含有EGFP，本研究用紅色熒光Annexin V-PE/7-AAD 雙色染料檢測細胞凋亡發生率［9］。本研究發現外源性ARA55 表達上調后，CNE2 細胞凋亡率明顯升高。崔巍等［14］的研究也顯示，在大腸癌細胞中上調ARA55 后，發生凋亡的細胞數量明顯增加。細胞發生凋亡后，可產生片段化的DNA［16-18］。本研究提取轉染72 h后的細胞基因組DNA，經電泳發現ARA55過表達組細胞基因組DNA 發生片段化明顯。進一步檢測凋亡相關蛋白的表達變化，發現上調ARA55表達后，CNE2 細胞中Bcl-2 蛋白表達下調，下游的Cytochrome C 蛋白的表達升高，Caspase-9 的剪接體及激活型Caspase-3（只檢測Asp175 剪切后產生的19 kD 和17 kD 的剪接體）表達均明顯升高。以上結果提示，ARA55 過表達可激活內源性線粒體凋亡通路誘導CNE2 細胞凋亡，結果與文獻的報道基本一致［14］。

綜上所述，上調CNE2 中ARA55 表達可抑制細胞的生長增殖和體外侵襲轉移能力，并能夠激活內源性線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。