基于蘆筍榨汁殘渣發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶酵素

蘇政波，劉寶祥，傅茂潤，馬闖

1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室（濟南 250013）；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟南 250353）

蘆筍（Asparagus officinalisL），又名石刁柏、龍須菜，是一種多年生的健康蔬菜食品，被世界衛(wèi)生組織列為世界十大最具有營養(yǎng)價值的蔬菜之首，具有營養(yǎng)高、能量攝入低的特點，是國際上公認的防癌保健蔬菜[1]。蘆筍具有豐富的營養(yǎng)，可以被檢出多糖、有機酸、氨基酸、甾體皂苷、黃酮、多肽及衍生物、多酚（羥基肉桂酸、黃酮、芪類、木酚素和去甲木脂素）等多種功能性物質(zhì)，許多研究證明，蘆筍具有降膽固醇、保肝、抗腫瘤、降血壓、保腎、抗糖尿病、改善睡眠、抗焦慮等作用[2-3]。蘆筍根中含有36.8%~52.89%糖類、17.93%粗纖維、2.95%~6.1%蛋白質(zhì)、4.1%~8.83%皂苷、5%~6.2%油類、4.18%無機物，此外還有少量維生素C、黃酮和多酚。由于根部可以積累皂苷和果聚糖等，也常在中醫(yī)中被用作輔助藥物[4]。

超氧化物歧化酶（SOD）為廣泛存在于生物機體內(nèi)抗氧化酶的總稱，能夠清除動植物體內(nèi)自由基和活性氧（ROS）[5]，普遍存在于酵母菌、動植物及所有真核細胞的生物中，在預(yù)防衰老和抗氧化等方面起到重要作用。SOD是抵抗ROS損傷的第一道防線，能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)化為氧和過氧化氫，再由過氧化物酶分解為氧分子和水，從而避免機體的損傷[6-7]。根據(jù)其活性位點的金屬離子可將SOD分為4類：銅鋅-SOD、錳-SOD、鐵-SOD和鎳-SOD。Cu/Zn-SOD主要存在于真核細胞的細胞質(zhì)、葉綠體和壁膜間隙中；Mn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中；Fe-SOD主要存在于原核生物、原生動物、少數(shù)幾種藻類和植物中；Ni-SOD的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬和藍細菌中存在[6]。

已報道的研究主要通過收集葡萄酒或啤酒的廢酵母，采用超聲波破壁等方式破碎酵母細胞，以促進酵母胞內(nèi)物質(zhì)溶出，達到分離提取SOD的目的[8-12]。未提出成熟產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方案，SOD的分離溶出所用試劑不能滿足食用的要求，長期保存的方式等未見報道。蘆筍殘渣為制造蘆筍濃縮汁過程中產(chǎn)生的廢棄物，在壓榨取汁后仍殘余較多營養(yǎng)物質(zhì)，如纖維素和蛋白質(zhì)。近年來，國際上蘆筍種植和加工發(fā)展迅速，國內(nèi)用蘆筍原料開發(fā)蘆筍飲料，有關(guān)蘆筍綜合利用及提高原料利用率的研究也不斷出現(xiàn)，蘆筍廢料的利用也越來越受到重視。

試驗利用蘆筍榨汁過程產(chǎn)生的廢物殘渣，提高蘆筍利用率，所添加物質(zhì)為食品級，可直接食用。蘆筍殘渣富含膳食纖維和其他營養(yǎng)物質(zhì)，又可提供合成SOD所需的微量離子成分，通過添加酵母菌進行好氧發(fā)酵，代謝營養(yǎng)物質(zhì)，同時在胞內(nèi)累計SOD，通過破壁使胞內(nèi)酶系溶出，以生產(chǎn)蘆筍SOD酵素，為產(chǎn)品的進一步應(yīng)用提供方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆筍（市售，產(chǎn)地為菏澤市）；纖維素酶、復(fù)合植物水解酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶（青島康地恩生物科技有限公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（南京建成科技有限公司）；白酒酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母（湖北安琪酵母有限公司）；麥芽提取物（上海金啤生物科技有限公司）；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等為分析純；所用水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

HR1863榨汁機[飛利浦（中國）投資有限公司]；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；L550低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；VCX 600超聲波反應(yīng)器（Sonics &Materials，Inc.）；40-10S高壓均質(zhì)機（上海東華高壓均質(zhì)機廠）；722型可見分光光度計（上海菁華生化試劑儀器有限公司）；SPH-2101立式雙層恒溫搖床（上海世平實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 還原糖的測定

按照 GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中還原糖的測定》執(zhí)行[13]。

1.3.2 蛋白質(zhì)的測定

按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中蛋白質(zhì)的測定》執(zhí)行[14]。

1.3.3 超聲波破壁條件

發(fā)酵完成后，自然pH，冰水浴中在超聲波功率300 W條件下超聲波破壁處理15 min，按4 000 r/min離心10 min，收集上清液，待檢。

1.3.4 超氧化物酶酶活力測定

蘆筍酵素中SOD主要為Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，總超氧化物酶活力測定按照總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（羥胺法）進行?？係OD活力（U/mL）按式（1）計算。

1.3.5 基本工藝

蘆筍→清洗→榨汁→殘渣→烘干→粉碎→過篩→復(fù)水→酶解→滅菌→接種→發(fā)酵→破壁→干燥→包裝

2 結(jié)果與分析

2.1 原料制備

取適量新鮮蘆筍，清洗后使用榨汁機榨汁，留取殘渣置于50 ℃烘箱烘干至水分10%以下，使用粉碎機進行粉碎，取過0.075 0 mm（200目）孔徑篩樣品備用。取適量蘆筍殘渣，按照料水比1∶20（g/mL）定容，諾維信纖維素酶、復(fù)合植物水解酶和康地恩半纖維素酶各0.1%酶添加量，在自然pH條件下50 ℃酶解150 min；加入蘆筍殘渣質(zhì)量0.1%木瓜蛋白酶，于50℃酶解120 min。經(jīng)檢測，總糖質(zhì)量濃度為12.56 g/L，水溶性蛋白質(zhì)量濃度為0.469 g/L。

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 料水比確定

取酶解好的物料，調(diào)整料水比至1∶20，1∶30和1∶40（g/mL），在121 ℃條件下滅菌20 min，接種葡萄酒酵母，在搖床28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵60 h。發(fā)酵完成后，超聲波破壁，破壁率達到95%以上，檢測SOD酶活力。

從圖1可以看出，隨著加水量加大，料水比1∶20和1∶30（g/mL）條件下SOD酶活力接近，料水比1∶40（g/mL）條件下SOD酶活力較低。料水比1∶20（g/mL）發(fā)酵后的物料性狀達不到后續(xù)均質(zhì)的要求，因此，選擇1∶30（g/mL）作為發(fā)酵時的料水比。

圖1 不同料水比發(fā)酵SOD酶活力

2.2.2 發(fā)酵過程SOD酶活力的變化

酶解后，調(diào)整料水比1∶30（g/mL），在121 ℃條件下滅菌20 min，接種葡萄酒酵母，在搖床28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵。分別取樣，檢測酵母菌數(shù)，超聲波破壁后，檢測SOD酶活力。

由圖2可知，隨著發(fā)酵進行，酵母細胞數(shù)和SOD酶活力逐漸上升，酵母細胞數(shù)在48 h達到最高，SOD酶活力在72 h達到最大。SOD為胞內(nèi)酶，隨著酵母菌的增殖，SOD酶活力逐漸升高，但并非與酵母細胞數(shù)增長完全對應(yīng)。可能由于酵母菌的傳代，SOD抵抗自由基的危害和菌體衰老，使得SOD酶活力上升[15]。

圖2 發(fā)酵過程中SOD酶活力和細胞數(shù)的變化

2.2.3 營養(yǎng)源比較

酶解后，調(diào)整料水比至1∶30（g/mL），分別添加1%葡萄糖、1%麥芽提取物、1%葡萄糖和1%麥芽提取物，在121 ℃條件下滅菌20 min，接種葡萄酒酵母，在搖床28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵。分別取樣，超聲波破壁，檢測SOD酶活力。

由圖3可知，在酶解液中添加不同的營養(yǎng)源對SOD酶活力有較大的影響，相比不添加營養(yǎng)源（圖1），同樣發(fā)酵時間60 h，SOD酶活力分別提升17.42%，69.87%和21.15%。添加麥芽提取物對SOD酶活力提高效果最好，可能由于麥芽提取物中營養(yǎng)豐富，還原糖和游離氨基氮能夠顯著促進酵母菌的生長和增殖，從而促進SOD酶活力的提高。添加葡萄糖和麥芽提取物可能造成還原糖濃度較高，抑制菌體的生長和SOD的產(chǎn)生。添加麥芽提取物還可縮短發(fā)酵時間，顯著縮短發(fā)酵周期，48 h時SOD酶活力達到最高。

圖3 不同營養(yǎng)發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化

2.2.4 不同酵母比較

酶解后，調(diào)整料水比至1∶30（g/mL），添加1%麥芽提取物，在121 ℃條件下滅菌20 min，分別接種白酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母，在搖床28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵。分別取樣，超聲波破壁，檢測SOD酶活力。

通過比較3種不同菌種發(fā)酵過程中SOD的活性變化，葡萄酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生SOD酶活力最高，啤酒酵母次之，白酒酵母最低。葡萄酒酵母更適宜試驗的原料和發(fā)酵方式。

2.3 破壁條件的影響

超高壓均質(zhì)是一種具有廣闊前景的非熱加工技術(shù)，通過均質(zhì)閥控制流體通過間隙的大小，產(chǎn)生高壓、高速，達到高剪切、高速碰撞、空穴效應(yīng)等作用[16]。同時，由于其可控制于低溫運行，不會破壞食品的營養(yǎng)、風(fēng)味和熱敏物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于破碎分散、減小顆粒粒徑、代謝產(chǎn)物提取等生產(chǎn)。由于SOD為胞內(nèi)酶，獲得適宜的產(chǎn)品需先將其細胞壁破碎，才能使胞內(nèi)物質(zhì)溶出。試驗以超聲波破壁為參照，探索超高壓均質(zhì)技術(shù)對酵母菌進行細胞破壁的條件。

2.3.1 均質(zhì)壓力的影響

酶解后，調(diào)整料水比1∶30（g/mL），添加1%麥芽提取物，在121 ℃條件下滅菌20 min，接種葡萄酒酵母，在搖床28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵48 h以上，將發(fā)酵液降溫至10 ℃以下，通入高壓均質(zhì)機于不同壓力下進行破壁。

由圖5可知，隨著均質(zhì)壓力增大，SOD酶活力不斷提高，說明隨著均質(zhì)壓力增大，酵母菌能夠逐漸破碎。均質(zhì)壓力達到80 MPa，SOD酶活力可以達到與超聲波破壁類似的效果，與相關(guān)報道一致[17]。所以，酵母菌破壁所需均質(zhì)壓力選擇80 MPa以上。

圖4 不同酵母菌發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化

圖5 不同均質(zhì)壓力下SOD酶活力的變化

2.3.2 均質(zhì)次數(shù)的影響

發(fā)酵48 h后，將發(fā)酵液降溫至10 ℃以下，設(shè)置高壓均質(zhì)機壓力80 MPa，通入發(fā)酵液，比較不同均質(zhì)次數(shù)SOD酶活力的變化。

由圖6可知，均質(zhì)2次相比1次，SOD酶活力提高6.64%，說明均質(zhì)2次能夠達到更好的破壁效果，促進胞內(nèi)物質(zhì)的釋放。均質(zhì)3次相比2次SOD酶活力降低20.27%，均質(zhì)次數(shù)過多或時間過長，高剪切和空穴效應(yīng)可能造成一定SOD的失活。

圖6 不同均質(zhì)次數(shù)下的SOD酶活力

2.4 酵素功能活性評價

發(fā)酵48 h后，將發(fā)酵液降溫至10 ℃以下，設(shè)置高壓均質(zhì)機壓力80 MPa，通入發(fā)酵液，均質(zhì)2次，將破壁發(fā)酵液速凍，進行冷凍干燥，經(jīng)檢測其SOD酶活力為403 U/g，酶活力基本無損失。

2.4.1 蘆筍酵素在模擬胃液中的活性變化

經(jīng)美國藥典查詢并改良：空腹時，胃液的pH 1.5；餐后胃液pH 3.0。配制模擬胃液：0.2% NaCl，加入950 mL蒸餾水，用鹽酸分別調(diào)節(jié)pH為1.5和3.0，并定容到1 000 mL。模擬蘆筍酵素在胃液高酸度條件下，SOD酶活力與時間的變化。

人體飲食先經(jīng)過咀嚼再經(jīng)食道到達胃內(nèi)，溫水溶解蘆筍酵素可迅速到達胃中。胃液中pH較低，對食物活性影響較大。蘆筍酵素在pH 3.0條件下，1 h內(nèi)SOD酶活力保持86%，3 h內(nèi)SOD酶活力保持約63.5%，較短時間可以保持蘆筍酵素的活性。在pH 1.5條件下，SOD酶活力的損失相對比較大，1 h內(nèi)SOD酶活力損失超過32%，3 h SOD酶活力損失超過50%。相比之下，蘆筍酵素在餐后飲用為佳，能保持較好的活力。

2.4.2 溶解溫度對蘆筍酵素酶活性的影響

由于溫度對各種酶的酶活力均有較大影響，溫度過高可能使酶產(chǎn)生不可逆失活。針對凍干后樣品，使用不同溫度純凈水保溫10 min，檢測溫度對SOD酶活力的影響。

由圖8可知，不同溶解溫度對SOD酶活力影響較大，50 ℃內(nèi)酶活力損失在5%以內(nèi)；溶解溫度超過60℃，酶活力損失接近50%，損失較大。因此，應(yīng)使用50 ℃以下常溫水或牛奶溶解飲用。

圖7 模擬胃液中SOD酶活力的變化

圖8 不同溶解溫度對SOD酶活力的影響

3 結(jié)論

通過對蘆筍榨汁殘渣的發(fā)酵、破壁和SOD活性研究，確定蘆筍榨汁殘渣發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶全營養(yǎng)酵素的工藝條件：調(diào)整料水比1∶30（g/mL），添加1%麥芽提取物，在121 ℃條件下滅菌20 min，降溫后接種葡萄酒酵母，在28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵48 h；將發(fā)酵液降溫至10 ℃以下，壓力80~90 MPa均質(zhì)2次，進行冷凍干燥，得到酵素成品。經(jīng)檢測，其SOD酶活力為403 U/g，呈黃色，具有蘆筍的典型香氣和酵母味，溶解后香氣濃郁、無異味，溶解分散性較好。產(chǎn)品既含有蘆筍中原有的膳食纖維、蛋白質(zhì)，又經(jīng)過酵母菌發(fā)酵和破壁，富含SOD、酵母胞內(nèi)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，經(jīng)模擬胃液和溫度條件的探索，建議餐后使用50 ℃以下常溫水或牛奶溶解飲用。經(jīng)過半年的常溫陰涼處儲存，蘆筍酵素的活性保持較好，SOD酶活力的損失在10%以內(nèi)，可常溫長時間保存。