高效液相色譜法測定多西他賽血藥濃度的價值分析

陳權耀，林 閩（通訊作者）

（廈門大學附屬婦女兒童醫院<廈門市婦幼保健院>藥學部 福建 廈門 361003）

乳腺癌是女性群體中最常見的癌癥之一，占所有癌癥的30%[1]。由于人口基數大，中國乳腺癌人群的發病人數和死亡人數均位世界第一[2]，嚴重影響女性生命健康。多西他賽（docetaxel, DTX）是歐洲紅豆杉針葉提取物（紫杉醇）的半合成類似物。其作用機制與紫杉醇類似，通過與微管蛋白的β 亞基結合，促進微管聚合或抑制其分解，使微管功能喪失而穩定存在，導致有絲分裂阻滯，從而誘導細胞的凋亡[3]，最終達到抑制癌細胞的增殖及侵襲，進而有效治療癌癥的目的。與紫杉醇相比，其具有更優的藥動學特性和較輕的不良反應。然而，在臨床實踐過程中，依據臨床經驗或者美國國立綜合癌癥網絡等相關指南給予不同患者一定劑量多西他賽時[4-5]，部分患者難以達到最佳治療效果，且患者出現不良反應（如骨髓抑制、變態反應、高血壓、嘔吐、心慌心悸）的類型及程度不一，多西他賽的療效和不良反應存在較大的個體差異。有學者研究發現個體間療效及不良反應差異的出現，在一定程度上與多西他賽體內的藥代動力學存在個體差異有關[6-7]。故建立高效液相色譜（HPLC）法檢測多西他賽血藥濃度，以期能為多西他賽藥代動力學及臨床探尋最佳劑量提供方法學基礎。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 多西他賽對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100666-201704，含量99.2%），地西泮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171225-200302，含量100%），乙醚、甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 儀器

Agilent1260 系列高效液相色譜儀；HL-104 電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；TGL-16gR 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW-80A 漩渦混合器（海門市麒麟醫用儀器廠）；CLEAN PH500 臺式測試儀（CLEAN儀器有限公司）。

1.3 樣本

空白血漿：由廈門市婦幼保健院檢驗科提供。

1.4 方法

1.4.1 溶液的配制 （1）對照品的配制：精密稱取多西他賽10.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，定容搖勻，配制成1 000 mg·L-1標準貯備液。（2）內標液的配制：精密稱取地西泮10.0 mg 置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，定容搖勻，配制成100 mg·L-1內標液。配制液均放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 血樣處理 取500 μL 空白血漿加入10 μL 多西他賽溶液和2 μL 內標液，漩渦振蕩1 min；加入乙醚800 μL，漩渦振蕩3 min，12 000 r/min 離心5 min（2 ～8 ℃），取上層清液于500 μL 至氮氣揮干，殘渣用60 μL 流動相復溶，漩渦振蕩1 min，13 000 r/min 離心1 min（2 ～8 ℃），取上清液進樣。

1.4.3 色譜條件 色譜柱：日本島津Insertil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相：水：乙腈（55:45）；柱溫30 ℃；檢測波長228 nm；流速1 mL·min-1；進樣量：40 μL。

2.結果

取空白血漿、空白血漿加對照品、患者血漿各500 μL，按“3.2”項下操作，記錄色譜圖。地西泮保留時間為17.474 min，多西他賽保留時間為23.812 min。拖尾因子為0.96，R ＞1.5，峰形良好且重復性好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖（A-空白血漿；B-加樣血漿；C-患者血漿；1-地西泮；2-多西他賽）

2.1 標準曲線制備

取多西他賽標準液，用純化水分別稀釋成為2.5、5、10、20、40、60、80 mg·L-17 個濃度的標準溶液，取空白血漿490 μL 置1.5 mL EP 管中，分別加入多西他賽標準溶液10 μL 和內標物2 μL，渦旋混勻，配制成標準濃度分別 為50、100、200、400、800、1 200、1 600 μg·L-1。另取空白血漿490 μL，加入0.9%氯化鈉溶液10 μL，與空白血漿490 μL，加入0.9%氯化鈉溶液與內標物各5 μL隨行檢測。按“1.4.2”項下操作，地西泮為內標物。以多西他賽質量濃度為橫坐標（X），對照品峰面積/內標液色譜峰面積為縱坐標（Y），進行回歸，得到標準曲線方程為Y= 0.0019X+0.0135，r2= 0.9993；按信噪比S/N≥10，多西他賽最低定量限為10 μg·L-1。

2.2 回收率與精密度試驗

配制含多西他賽50、100、400、1 200 μg·L-14 種濃度血漿樣品，按“1.4.2”項下處理，記錄多西他賽峰面積A1，另取4 種濃度多西他賽，用流動相制備樣品，記錄多西他賽峰面積A，以A1/A 的值，即為提取回收率；配制含同樣濃度血漿樣品，按“1.4.2”項下處理并進行檢測，記錄峰面積代入標準曲線進行計算，所得實際濃度和理論濃度的比值即為方法回收率，見表1。

表1 HPLC 方法測定多西他賽血藥濃度回收率

2.3 HPLC 方法測定多西他賽血藥濃度精密度

配制上述4 種濃度血漿樣品，按“1.4.2”項下處理并進行檢測；同日重復測定5 次并連續測定5 d，即日內精密度和日間精密度，見表2。

表2 HPLC 方法測定多西他賽血藥濃度精密度

2.4 樣品穩定性試驗

配制上述，4 種濃度血漿樣品，分別在室溫下放置1 h，4 ℃下放置24、48 h，-30 ℃放置1 周，反復凍融3 次，每種濃度在各自條件下均平行測定5 次，即樣品穩定性，見表3。

表3 HPLC 方法測定多西他賽血藥濃度穩定性

3.討論

3.1 方法的選擇

目前國內外對于多西他賽濃度的檢測方法包括液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）[8]以及高效液相色譜法[10]；LC-MS/MS 以質譜為檢測器，靈敏度較高，但其線性關系較差，單次檢測可能存在較大的偏差，且儀器價格昂貴，難以普及；目前國內已有采用HPLC 法測定多西他賽血藥濃度的報道。但檢測限為0.64 mg·L-1，遠高于實際檢測濃度范圍，而本實驗所建立方法檢測限10 μg·L-1，更適于實際檢測。

3.2 樣品前處理

文獻[9]中關于血漿樣本的處理，為叔丁基甲醚反復萃取。前期試驗發現，等量溶劑萃取時，叔丁基甲醚揮干較乙醚困難；單次萃取時叔丁基甲醚提取回收率為56.41%，乙醚的提取回收率為80.25%；而反復3 次萃取時叔丁基甲醚與乙醚提取回收率分別為84.25%和85.26%，相差較小，故而選用操作更為簡易的乙醚進行單次萃取。

3.3 色譜條件優化

前期試驗發現，采用磷酸緩沖體系并未對峰形及保留時間有明顯影響。且因磷酸鹽會降低色譜柱的使用壽命，故采用乙腈-水作為流動相，通過調整確定乙腈-水的比例為45:55。

近期研究顯示，隨著游離多西他賽在血液中濃度的升高，臨床緩解率和病理緩解率也相應增高，但是隨著暴露量的增大，毒性也隨之增加，特別是骨髓抑制方面的血液毒性[10]。故更需要進行多西他賽血藥濃度檢測以明確其分布特征及臨床效應。本實驗建立的多西他賽血藥濃度測定方法操作簡便，重復性好，分析時間短，靈敏度高，能準確測定多西他賽的血藥濃度，為乳腺癌患者群體藥代動力學的研究提供有效、簡便的方法學基礎。