飼料氨基酸的不同檢測方法在飼料生產中的比較研究

魏姜勉

（黃淮學院生物與食品工程學院，河南駐馬店 463000）

隨著我國居民生活水平的不斷提升，人們對動物蛋白質的需求量不斷增加。動物是人類食品中優質蛋白質的重要來源，發展畜牧養殖是一種快速提高畜禽類蛋白質產量的重要科學手段（張浩然等，2021）。畜牧業的發展與飼料中蛋白質的含量息息相關，飼料蛋白質將會轉化為動物蛋白質，從而提高畜禽生長速率，促進飼料蛋白質研究。蛋白質是動物飼料中的核心營養成分，蛋白質維持動物機體組織更新和生命代謝活動，是動物組織細胞膜的重要組成物質。因而，蛋白質含量是衡量動物飼料質量的重要指標，成為養殖戶的關注焦點（賀習文等，2021）。由于飼料中蛋白質是由氨基酸組成，蛋白質的營養代謝是以氨基酸代謝為主，氨基酸平衡是動物代謝的關鍵點。

隨著動物飼料質量和安全性不斷提高，確定飼料中蛋白質和氨基酸的合理配比，便于提高飼料蛋白質的利用率。飼料中氨基酸比例和種類是衡量飼料質量的重要參數（石長波等，2021；辛娜等，2021；謝偉，2021）。飼料中氨基酸平衡會提高動物對氨基酸的利用率，提高動物生長速率，進而節約飼料資源。因此，飼料中氨基酸的結構和組成是配制混合飼料的重要指標，而快速、準確測定動物飼料中氨基酸含量已成為飼料研究熱點。魚粉中氨基酸比例極佳，與其他動物氨基酸比例相似，飼料安全性好，便于消化，是重要的動物蛋白質來源，而豆粕是植物蛋白質原料的代表，且抗營養因子含量少，植物蛋白質含量豐富，來源豐富，易于獲得，已成為理想的植物蛋白質來源（謝偉，2021；孫播東等，2021；宋潔；2021）。因此，本研究選用魚粉和豆粕作為動物飼料氨基酸的測定對象。飼料中含有的氨基酸比例和含量是檢測飼料質量高低的重要指標。目前，氨基酸的測定方法為常規化學分析、色譜分析和光譜分析等，利用鹽酸水解法測定氨基酸，該方法適用性強，易于蒸發，方便操作。本研究使用近紅外光譜儀對飼料樣品中氨基酸的含量進行光譜掃描，準確測定各種氨基酸的含量和常規成分分析，節約人力資源，對氨基酸進行濕化學分析的數據作為基礎模型，對掃描樣品與濕化學分析結果對比，驗證樣品模型的準確性。本研究對氨基酸種類的處理方法和液相色譜儀分離進行優化，建立簡便、準確的紫外檢測分析氨基酸方法，該方法分析速率快，靈敏度高，為分析飼料中氨基酸種類和含量提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 飼料樣品（大豆，豆粕，魚粉和混合飼料）

1.2 試驗試劑 甲醇、氯化鈉、苯酚、雙氧水、甲酸、抗壞血酸、硝酸銀、茚三酮、乙二酸甲醚、2，4-二硝基氯苯、乙氰、碳酸氫鈉、乙酸鈉、冰乙酸、氫氧化鋰、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉、低速離心機及乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

1.3 試驗設備 氨基酸分析儀、剪刀、鑷子、飼料粉碎機、天平、恒溫箱、渦旋儀、濃縮儀和溫度控制儀、高效液相色譜儀、C18色譜柱、電子天平、電熱鼓風干燥箱、pH酸度計、萬用電爐、超聲波清洗儀、電熱加熱爐、水浴鍋以及真空抽水泵等。

1.4.1 飼料樣品的預處理 將飼料樣品放入飼料粉碎機進行粉碎，將其放入分析篩（40目），稱取0.2 g樣品放入安培瓶中，加入氫氧化鋰20 mL，馬上接入氮氣，放入高溫水浴鍋中加熱到110℃水解，待其冷卻后將水解液放入100 mL容量瓶中加入乙酸鈉緩沖溶液定容，加入少量鹽酸進行中和，調節液體pH，定容和搖勻，取25 mL溶液放入低速離心機中離心30 min，取試管中的上清液，取上清液過濾有機膜（0.45 um），放入高效液相色譜儀檢測。

1.4.2 飼料標準樣品的配置 稱量0.1 g（0.0001g）飼料中常見的 20種氨基酸標準樣品，放置于250 mL容量瓶中，使用0.1 mol/L鹽酸定容，混勻，得到1000 mg/L的20種氨基酸混合標準液體，放入4℃冰箱中保存備用。將原溶液1000 mg/L 稀 釋 為 750、600、550、450、350、250、150、50和25mg/L的氨基酸混合標準溶液，放入4℃冰箱中備存。

1.4.3 飼料樣品曲線的制備 移取100 uL的750、600、550、450、350、250、150、50 和 25 mg/L的20種氨基酸的混合標準溶液放入有機膜進行過濾，進樣量為10 uL，使用相關軟件進行檢測。以20種氨基酸的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制飼料樣品氨基酸的標準曲線。

1.4.4 高效色譜調節條件 高效液相色譜儀的調節條件為C18色譜柱，流動相A為甲醇；B流動相為乙酸-乙酸緩沖液，流動相為1mol/min；進樣品量為10 uL，柱溫度為32℃，紫外線波長為280 nm，等度洗脫，A流動相：B流動相為=1：9。

1.5 微波水解-氨基酸分析方法 稱取一定量的飼料樣品，將其溶解于水中，加入1 mol/L的鹽酸溶液4.8 mL，當飼料樣品全部濕潤后沖入定量的氮氣，固定瓶蓋，放入微波儀中，連接溫度傳感器，按照設定程序進行操作，等待罐內溫度降低到50℃取出水解液體，放入250 mL容量瓶中定容和過濾，將樣品放入氨基酸分析儀器中測定。

1.6 近紅外分析光譜法

1.6.1 飼料樣品預處理 本實驗樣品均使用飼料粉碎儀進行破碎，然后進行混勻，放入4℃冰箱保存備用。魚粉樣品脫脂處理，然后烘干，再進行粉碎。

1.6.2 樣品氨基酸測定 將飼料樣品加入蛋白質裂解液后，制定標準氨基酸溶液和測定樣品氨基酸溶液，放入氨基酸分析儀中測定，采用梯度洗脫方式來洗脫氨基酸組成，組間加入氨基酸標準溶液校正，對氨基酸樣品進行定量測定，對所有樣品的氨基酸進行濕化學測定。

為進一步比較兩種快速檢測方法相對于原吸法檢測結果的一致性，明確兩種快速檢測方法各自的優越性與局限性，本研究對三種方法針對同一批稻谷樣本的檢測結果進行了統計學上的初步分析，計算了三種方法之間的差異程度與相關性水平，探討了兩種快速檢測方法的實際應用效果與使用范圍，以期對糧食收儲先檢后收工作提供幫助。

1.6.3 樣品模型建立 采用Win ISI III光譜分析軟件和OPUS軟件對19種氨基酸的化學測定值進行相關聯性分析，建立豆粕和魚粉等飼料氨基酸和常規指標含量分析預測模型。

1.6.4 檢驗樣品的準確性 采用近紅外光譜分析儀掃描驗證樣品進行預測數據，與之前的數據進行對比，采用T檢驗預測模型的正確性。

2 結果與分析

2.1 飼料氨基酸不同測定方法的水解條件對比分析 為了確定不同測量方法對飼料氨基酸水解時間的影響，選用魚粉和豆粕等試驗樣品進行預試驗，飼料樣品氨基酸水解方法按照不同測定方法條件設定的參數進行實驗，對比結果如表1所示。微波水解處理飼料氨基酸樣品的溫度為165℃，處理時間為25 min，飼料樣品中水解氨基酸的值均超過標準水解條件氨基酸的值，高效液相色譜法水解飼料氨基酸樣品的溫度為150℃，水解時間為20 min，飼料中水解氨基酸的值接近標準條件的氨基酸值；近外光譜分析法水解飼料氨基酸的溫度為180℃，處理時間為28 min，飼料樣品中水解氨基酸的值遠超過標準水解條件的氨基酸值；通過對比實驗飼料氨基酸處理效果，高效液相色譜法水解氨基酸的時間最短，處理溫度最低，實驗效果最佳。

表1 不同分析方法處理樣品氨基酸的對比分析

2.2 不同測定方法的水解鹽酸濃度飼料氨基酸峰面積的對比分析 將飼料樣品加入不同濃度梯度的鹽酸溶液（3、5、7、9、11mol/L）中，放入水浴鍋中水解后，取上清液過濾后放入氨基酸分析或高效液相色譜儀中測定氨基酸種類，以峰面積大小為指標，確定最佳的鹽酸濃度。

在不同測定方法的飼料氨基酸樣品中分別加入不同濃度梯度的鹽酸，并測定氨基酸峰面積結果，分析結果如下圖1～3所示。試驗結果表明，鹽酸溶液濃度從3 mol/L增加到7 mol/L時，隨著鹽酸濃度的增加，氨基酸的峰面積呈現遞增趨勢，其原因為鹽酸濃度太低，氨基酸沒有完全水解，當濃度為7 mol/L時，氨基酸的峰面積最大，當濃度從7 mol/L增加到11 mol/L時，氨基酸的峰面積呈現下降趨勢，主要原因是鹽酸濃度較高，氨基酸結構被破壞。通過對氨基酸峰面積的對比分析：高效液相色譜法的氨基酸峰面積較大，測定結果較好，而近外光譜分析法中氨基酸的峰面積較小，結果值較少。

圖1 微波水解-氨基酸自動分析法的不同鹽酸濃度測定的氨基酸面積

圖2 高效液相色譜法的不同濃度鹽酸測定的氨基酸面積

圖3 近紅外光譜分析法的不同濃度鹽酸測定的氨基酸面積

2.3 不同分析方法對飼料氨基酸測定結果的影響 由表2可知，高效液相色譜測定飼料中氨基酸的組成與標準成分結果相似，各類氨基酸相似程度偏差范圍為0.01%～0.2%；微波處理方法測定飼料中氨基酸的組成與標準成分結果相差較大，各類氨基酸相似偏差范圍為2.34%～6.34%；近外光譜法測定飼料氨基酸的組成與標準測定結果相差較小，偏差程度范圍為0.24%～0.98%；通過結果對比分析：高效液相色譜法測定飼料氨基酸的結果與標準測定結果相似，結果偏差程度較小。

表2 不同分析方法對飼料氨基酸的組成影響

2.4 不同分析方法對飼料氨基酸穩定性分析 由表3可知，高效液相色譜測定飼料中氨基酸穩定性與標準成分結果相似，各類氨基酸相似程度偏差范圍為0.01%～0.16%；微波處理方法測定飼料中氨基酸的穩定性與標準成分結果相差較大，各類氨基酸相似偏差范圍為1.51%～4.55%；近外光譜法測定飼料氨基酸的穩定性與標準測定結果相差較小，偏差程度范圍為0.24%～0.68%；對結果進行對比分析發現，高效液相色譜法測定飼料氨基酸的穩定性結果與標準測定結果相似，穩定性較強。

表3 不同分析方法對飼料氨基酸穩定性的影響

2.5 不同分析方法對不同飼料氨基酸總量測定結果比較分析 由表4可知，高效液相色譜法的測定結果與標準測定結果類似，變異系數與標準差最小，而微波水解處理方法測定其飼料氨基酸的總量高于飼料的標準測定含量，變異系數和標準差較大，而近外光譜分析法對飼料氨基酸總量分析影響程度較小，標準差在0.13～0.26之間，綜合比較發現，3種檢測方法已達到檢測標準，滿足飼料氨基酸檢測要求。

表4 不同分析方法對不同飼料氨基酸總量測定結果比較分析

3 討論

3.1 飼料氨基酸中不同分析方法的優劣勢對比分析 本研究飼料樣品采用微波水解法進行氨基酸測定。并確定微波水解條件為165℃，加熱25 min，該方式操作簡單，縮短水解時間，提高飼料氨基酸的水解效率。飼料氨基酸的水解時間從原來20 h縮減為1 h，宋潔等（2021）對飼料蛋白質烘箱加熱160℃進行水解，水解時間為2 h；任曉宇等（2017）對飼料原料用加熱器進行水解，加熱溫度為160℃，水解時間為50 min，這些結果證明，微波水解方法正確，160℃是氨基酸水解的合適溫度，能廣泛應用于飼料氨基酸的檢測。微波是一種300MHz的電磁波，能被水和食品廣泛吸收，因而有機物能吸收電磁波能量而達到加熱效果，大大提高了反應物的加熱效率，縮減加熱時間。水分子吸收微波能量效率極高，能快速完成飼料水解過程，提高飼料檢測效率，操作簡單、節約能耗、安全環保、成本較低，且利用效率高。

本研究采用近紅外光譜分析法對飼料氨基酸樣品進行分析，確定水解條件為175℃，加熱時間為28 min，應用近紅外光譜分析技術對豆粕和魚粉等氨基酸含量建立預測模型，結果表明，近外光譜分析技術的基礎模型比較穩定，對飼料氨基酸含量預測準確，檢測時間快速。近紅外光譜分析技術是一種新型測定技術，可利用化學數據庫建立相關模型，可快速、準確地預測飼料氨基酸含量。石長波等（2021）對食品檢測采用近紅外光譜分析方法，結果表明，近紅外光譜法可有效檢測食品質量。謝偉等（2021）研究近紅外光譜分析技術在化工上的應用分析，它能快速檢測結果，效率高，精準度高，時效高，測試度數方便，檢測效果精準（程傳民等，2020；張元可等，2019）。這些結果表明，近紅外光譜分析法有效應用于飼料氨基酸的檢測。

本研究采用高效色譜法對飼料氨基酸含量的測定，本方法水解溫度為160℃，時間為20 min，與前2種方法對比發現，該方法能有效縮短水解時間，提高水解效率，操作方便，檢測效率高，節約能量，降低工作強度，提高工作效率。因此，本研究采用高效液相色譜法對氨基酸的檢測效果更好。孫播東等（2021）發現，高效液相色譜法能精準測定飼料中尼卡巴嗪含量，與本研究結果類似。本研究對色譜柱、流動相及波長進行設定，建立氨基酸液相色譜法，且其氨基酸的測定含量在誤差范圍內，精密度較高，說明該方法的靈敏度、精準度較高，能對飼料氨基酸進行定量分析。

3.2 不同分析方法對飼料氨基酸測定的影響因素分析 本研究結果發現，不同濃度的鹽酸對氨基酸峰面積有較大影響，鹽酸濃度過高，氨基酸峰面積下降，其原因可能是氨基酸被破壞；鹽酸濃度過低，氨基酸峰面積較小，其原因是氨基酸沒有被完全水解，使用高效液相光譜分析法測定氨基酸含量，向其樣品中加入不同濃度的鹽酸，氨基酸峰面積較高，這說明該方法測定效率高，而近紅外光譜分析法中加入不同濃度氨基酸樣品，氨基酸峰面積較小，說明飼料中氨基酸的含量測定與不同測定方法有關，也可能與樣品純度有關。

本研究不同分析方法對飼料氨基酸組成與穩定性進行分析發現，高效液相色譜法對飼料氨基酸組成與穩定性的分析精準度較高，其結果與標準結果類似，偏差程度較小，而另外2種測定方法中飼料氨基酸的組成和穩定性與標準結果誤差較大，偏差程度較大，但都在誤差范圍內，這表明高效液相色譜法的精準度較高，在一定程度上反映出飼料氨基酸含量。因此，對飼料樣品中進行抽查氨基酸含量時，應根據實際情況采用不同的分析方法。

目前，分析飼料中氨基酸的不同檢測方法發現，高效液相色譜法的測定結果較為精準，但其也存在一定缺陷，如攜帶不方便、建立標準模型耗時；但近紅外光譜法的模型建立不太精準，測定水平參差不齊。因而，對飼料樣品中氨基酸含量的檢測應根據實際情況采用相應方法進行測定。

4 結論

本研究對微波水解法、近紅外光譜分析法和高效液相色譜法的優劣勢進行分析，結果發現，高效液相色譜法操作方便，檢測精準度高，檢測效率高，適用于飼料氨基酸含量的批量檢測。