纖維蛋白原的臨床檢測與應(yīng)用

馬麗云

（北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，北京 102206）

纖維蛋白原是一種分子量約為340,000 道爾頓的糖蛋白，在正常血漿中的濃度范圍是2～4g/L (200～400mg/dL)。它在肝臟中合成(1.7～5g/天)。纖維蛋白原的合成受編碼β 鏈合成的基因控制。由于該基因的遺傳多態(tài)性，血漿中的纖維蛋白原水平存在個(gè)體差異。纖維蛋白原的半衰期約為3～5 天。纖維蛋白原由6 條鏈組成：2Aα，2Bβ 和2γ。凝血酶(因子Ⅱa)將纖維蛋白原分子裂解成兩個(gè)纖維蛋白肽A(FPA)片段(從Aα 鏈)和兩個(gè)纖維蛋白肽B(FPB)片段(從Bβ 鏈)。由此產(chǎn)生的纖維蛋白單體聚合形成纖維蛋白，隨后在因子XIIIa 的作用下成為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。過程首先是兩個(gè)纖維蛋白單體的兩條γ 鏈結(jié)合。結(jié)合后的纖維蛋白是為D-二聚體(D-Dimer)的來源，D-Dimer 是纖維蛋白的特定降解產(chǎn)物。

纖維蛋白原含量增高見于糖尿病、急性心肌梗死、急性傳染病、結(jié)締組織病、急性腎炎、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)后、妊高征、急性感染、惡性腫瘤和應(yīng)急狀態(tài)等。降低常見于先天性低或無FIB 血癥、遺傳性FIB異常、DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化等。此外，纖維蛋白原還可能是心血管血栓性疾病的致病因素。因此纖維蛋白原的測定在臨床診斷上有很重要的臨床意義。

纖維蛋白原檢測試劑盒根據(jù)檢測原理可分為凝固法、免疫比濁法、磁珠攪拌法、Clauss 法等。

其中凝固法的檢測原理是在過量的凝血酶存在下，稀釋血漿的凝固時(shí)間可直接反映血漿中纖維蛋白原的水平；免疫比濁法：標(biāo)本中的FDP 與鼠抗FDP 單克隆抗體膠乳粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，產(chǎn)生凝聚導(dǎo)致濁度上升。通過分光光度計(jì)測定濁度變化率，求出FDP 的濃度。磁珠攪拌法：凝血酶是一種活力強(qiáng)大的，可做用于多種凝血因子的水解酶，其首要功能是使FIB分解生成FM 和兩個(gè)小肽碎片（A 肽和B 肽），A 肽和B 肽在FX Ⅲ及Ca2+作用下可以使一個(gè)分子的ε-賴氨酰基作為供體，以另外一個(gè)單體分子γ-谷氨酰基作為受體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，形成穩(wěn)定的纖維蛋白，生成的纖維蛋白所用的時(shí)間與纖維蛋白原的含量成反比，通過光電子法測定杯內(nèi)鋼球震幅的改變來測定凝固時(shí)間。Clauss 法：凝血酶可以將可溶性血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的多倍體纖維素，在高濃度凝血酶和低濃度纖維蛋白原的條件下，血漿凝固時(shí)間由纖維日蛋白原的濃度決定，在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，凝血酶凝固時(shí)間與纖維蛋白原的濃度呈反比的線性關(guān)系。

目前體外診斷試劑的市場上有很多關(guān)于纖維蛋白原測定的試劑盒。例如：纖維蛋白原測定試劑盒（凝固法）、纖維蛋白原測定試劑盒（免疫比濁法）、纖維蛋白原測定試劑盒（磁珠攪拌法）、纖維蛋白原測定試劑盒（Clauss 法）等。但是試劑盒之間也會(huì)存在技術(shù)差異，因此為了更好地判定試劑盒的檢測能力，以及檢測結(jié)果與臨床診斷的相關(guān)程度。選取任意兩個(gè)已上市銷售的纖維蛋白原測定試劑盒（凝固法）（以下簡稱試劑A）、纖維蛋白原測定試劑盒（免疫比濁法）（以下簡稱試劑B）/纖維蛋白原測定試劑盒（磁珠攪拌法）（以下簡稱試劑C）做了以下研究。

選取醫(yī)院科室日常檢驗(yàn)剩余枸櫞酸鈉血漿110 例，包括檢測水平正常及異常的樣本。樣本的處理方法為：采集9 份體積的血液于1 份體積0.109M(即濃度3.2%)的枸櫞酸鈉抗凝劑中。2,000-2,500g 離心15 分鐘。于20±5℃下保存不超過8 小時(shí)。選取的樣本要求：臨床剩余樣本；非嚴(yán)重溶血、混濁的樣本；未被微生物污染的樣本；樣本采集和處理符合標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室處理要求的樣本。數(shù)據(jù)處理的要求：統(tǒng)計(jì)時(shí)剔除超出線性的檢測樣本。樣本編盲要求：由非盲態(tài)研究者負(fù)責(zé)收集樣本，并將樣本去標(biāo)識化、符合要求的樣本應(yīng)在檢測前進(jìn)行編號，樣本編號的原則建議根據(jù)樣本納入的先后順序，給予一個(gè)4 位數(shù)的樣本號（按照入組順序?yàn)?01,002,003 等），如1001,1002 等。并保留樣本原始編號和新編號的對應(yīng)關(guān)系，以便試驗(yàn)數(shù)據(jù)的核查，編號完畢再由一位盲態(tài)研究者進(jìn)行測試。

在測定過程中，對樣本分別用受試試劑和對比試劑進(jìn)行測定，分別記錄測量值，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行如下分析。定量分析：根據(jù)試劑A 的測定結(jié)果與試劑B 的測定結(jié)果，求出線性回歸方程，計(jì)算樣本濃度范圍、相關(guān)系數(shù)（r）及常數(shù)的95%置信區(qū)間。定性分析：根據(jù)試劑A及試劑B說明書的各自規(guī)定，檢測結(jié)果在各自參考值范圍內(nèi)的，判斷為陰性；檢測結(jié)果在各自參考值范圍外的，判斷為陽性。如試劑A 和試劑B 的定性分析不符，則用試劑C 作為第三方檢測結(jié)果進(jìn)行檢測并判定。以試劑B 檢出結(jié)果作為參照，計(jì)算試劑A 的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率和研究試劑和對比試劑的一致性kappa值。陽性符合率：受試試劑陽性樣本占對比試劑陽性樣本的比例。陰性符合率：受試試劑陰性樣本占對比試劑陰性樣本的比例。總體符合率：檢出結(jié)果一致的樣本占總樣本的比例。kappa 值：受試試劑和對比試劑的一致性。

本次入組的樣本臨床診斷多為糖尿病、急性心肌梗死、急性傳染病、結(jié)締組織病、急性腎炎、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)后、妊高征、急性感染、惡性腫瘤和應(yīng)急狀態(tài)DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化等。根據(jù)此次試劑A 和試劑B 對入組的110 例樣本的檢測，其中1 例樣本對試劑A 和試劑B 均超出檢測上限，所以在最終統(tǒng)計(jì)中需剔除此樣本的檢測結(jié)果。因此最終對109 例樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行定量及定性的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下。

定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析：樣本數(shù)量109例，Y截距0.0307，相關(guān)系數(shù)0.9913，斜率0.9481，樣本濃度范圍1.55g/L-7.51g/L。設(shè)試劑B 測定結(jié)果為X，試劑A 測定結(jié)果為Y，經(jīng)計(jì)算，N=109 次，r=0.9913，P=0.000（P〈0.001），根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，兩組數(shù)據(jù)高度相關(guān)。一元線性回歸方程為：y=0.9481x +0.0307。對試劑A 和試劑B 的測定值的進(jìn)行線性回歸分析樣本濃度范圍為1.55g/L-7.51g/L，試劑A 和試劑B 的測定值的Pearson 相關(guān)系數(shù)（r）為0.9913，P〈0.001。以受試產(chǎn)品測定值為Y 變量，對比產(chǎn)品測定值為X 變量擬合線性回歸方程，y=0.9481x+0.0307，其回歸系數(shù)為0.9481，回歸系數(shù)的95%可信區(qū)間為0.919-0.967，常數(shù)的95%可信區(qū)間為-0.082 -0.130，線性回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 值=6095.451，P〈0.001），說明受試產(chǎn)品和對比產(chǎn)品檢測結(jié)果相關(guān)性良好。

定性統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析：根據(jù)試劑A 及試劑B 說明書的各自規(guī)定，試劑A檢測結(jié)果2g/L-4g/L 為陰性，其余檢測結(jié)果為陽性。試劑B 檢測結(jié)果2g/L-4g/L 的為陰性，其余檢測結(jié)果為陽性。試劑C 檢測結(jié)果2g/L-4g/L 為陰性，其余檢測結(jié)果為陽性。本次試驗(yàn)共檢測110 例樣本，對這110 例有效樣本進(jìn)行定性分析（其中在定量分析時(shí)，剔除的5 號樣本（原因：試劑A和試劑B 檢測結(jié)果均超出線性上限），有定性意義，故在本次定性分析時(shí)無需剔除）結(jié)果如下。以試劑B 檢出結(jié)果作為參照，計(jì)算試劑A 的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率和試劑A 和試劑B 的一致性kappa 值。陽性符合率＝(3+42)/(4+48)×100%＝86.54%，陰性符合率＝54/58×100%＝93.10%，總符合率＝(3+42+54)/110×100%＝90.00%，Kappa 值＝0.799。

不符樣本結(jié)果如下描述：樣本1：性別女，年齡33 歲，臨床診斷為乏力，腦血管病（慢性病），缺血性腦卒中恢復(fù)期，慢性胃炎，試劑A檢測結(jié)果4.02g/L，試劑B 檢測結(jié)果3.92 g/L，試劑C 檢測結(jié)果4.05 g/L；樣本2：性別男，年齡53 歲，腦血管病（慢性病），高脂血癥，試劑A 檢測結(jié)果2.03g/L，試劑B 檢測結(jié)果1.90 g/L，試劑C 檢測結(jié)果2.20g/L；樣本3：性別女，年齡64 歲，高脂血癥，動(dòng)脈硬化，腦血管病（慢性病），靜脈曲張，上感，試劑A檢測結(jié)果3.94g/L，試劑B檢測結(jié)果4.18g/L，試劑C檢測結(jié)果3.95g/L；樣本4：性別女，年齡41 歲，呼吸道感染，感冒，支氣管炎，試劑A 檢測結(jié)果3.70g/L，試劑B 檢測結(jié)果4.21g/L，試劑C 檢測結(jié)果4.55g/L；樣本5：性別女，年齡26 歲，急性播散性腦脊髓炎，肺部感染，血小板減少癥，高血壓（慢性病），試劑A 檢測結(jié)果3.91g/L，試劑B 檢測結(jié)果4.11g/L，試劑C 檢測結(jié)果4.47g/L；樣本6：性別女，年齡79 歲，腰椎間盤突出，腰椎管狹窄，腰痛，腰椎間盤突出，試劑A 檢測結(jié)果3.66g/L，試劑B 檢測結(jié)果4.28 g/L，試劑C 檢測結(jié)果3.98g/L；樣本7：性別男，年齡82 歲，腦血管病（慢性病），尿失禁，試劑A檢測結(jié)果4.10g/L，試劑B檢測結(jié)果3.98g/L，試劑C 檢測結(jié)果4.47g/L；樣本8：性別男，年齡29 歲，腦血管病（慢性病），急性腦梗死（左頂葉皮層及島葉），頸動(dòng)脈狹窄，試劑A 檢測結(jié)果1.83g/L，試劑B 檢測結(jié)果2.02g/L，試劑C 檢測結(jié)果2.44g/L；樣本9：性別男，年齡77 歲，糖尿病（慢性病），高血壓（慢性病），冠心病（慢性病），腦血管病，試劑A 檢測結(jié)果1.79 g/L，試劑B 檢測結(jié)果2.13g/L，試劑C 檢測結(jié)果2.07g/L；樣本10：性別男，年齡63 歲，冠心病（慢性病），冠心病（慢性病），糖尿病（慢性病），試劑A檢測結(jié)果3.87g/L，試劑B檢測結(jié)果4.21g/L，試劑C 檢測結(jié)果3.95g/L；樣本11：性別男，年齡65 歲，腦血管病（慢性病），動(dòng)脈粥樣硬化，高脂血癥，周圍神經(jīng)病，試劑A 檢測結(jié)果3.76g/L，試劑B 檢測結(jié)果4.18g/L，試劑C 檢測結(jié)果3.40g/L。

分析：本次臨床試驗(yàn)不符的樣本共11 例，其中：4 例樣本試劑B 檢測結(jié)果在參考值范圍內(nèi)，但試劑A 檢測結(jié)果在參考值范圍外；7 例樣本試劑B 檢測結(jié)果在參考值范圍外，但試劑A 檢測結(jié)果在參考值范圍內(nèi)；結(jié)合試劑C 的檢測結(jié)果分析：11 例不符的樣本中，有7 例樣本試劑A 檢測結(jié)果與試劑C 的檢測結(jié)果相符；4 例樣本試劑B 檢測結(jié)果與試劑C 的檢測結(jié)果相符。從測值來看，試劑A 與試劑B 兩組測值相近。且試劑A、試劑B、試劑C 的檢測結(jié)果三組測值相近。其中不符的測值都在參考值附近，不符的原因很可能是因?yàn)橄到y(tǒng)之間的差異造成，另外部分疾病本身對于測值也有一定影響，所以三種測值有可能會(huì)存在一定差異。但是這種差異對于臨床診斷的判別影響不大，因?yàn)榕R床醫(yī)生不會(huì)僅僅根據(jù)臨床的檢測結(jié)果進(jìn)行病人診斷，病人診斷的確定是根據(jù)病人針對性的檢查與臨床觀察和病人描述等多種因素綜合診斷得出。

根據(jù)此次任意選取的三種已上市的常見的纖維蛋白原檢測試劑盒作為檢測試劑，對110 例樣本同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)分析得出，不同的試劑盒對于同一份樣本的檢測結(jié)果之間存在差異，但此差異的出現(xiàn)可能是因?yàn)闄z測系統(tǒng)及樣本本身造成的，此類情況在臨床上是可以接受的。