林芝地區(qū)豬源大腸桿菌分離與鑒定

桑杰羅布

（西藏那曲市職業(yè)技術(shù)學(xué)校，西藏 那曲 852000）

前言

大腸桿菌病是由病原大腸桿菌引起的細菌性人畜共患病。多種類型疾病的總稱，病原性大腸桿菌一般以O(shè) 抗原進行。豬大腸桿菌病是目前西藏豬生產(chǎn)的主要疾病之一，它流行范圍大，發(fā)病率高，致死率強，臨床上以高熱、呼氣困難、排水樣或血色糞便、間進性消瘦和死亡特征，以及性出血性腸炎典型病理變化，大腸桿菌病是豬的重要傳染病，給豬接種大腸肝菌病苗，預(yù)防該病就顯得十分重要。病理變化一般為解剖檢自然病死豬，可見舌頭突出、皮下血管充血、淤血。主要病變急性出血腸炎，小腸漿膜毛細血管淤血、出血，腸管內(nèi)充充滿血性粘液。小腸粘膜水腫，腹腔積液，腸與瘤胃黏連在一起。腸系膜淋巴結(jié)腫脹，外觀和切面成黑色。肝小葉出血，肝臟腫大呈土黃色。膽囊嚴(yán)重腫大，膽囊壁增厚，膽汁渾濁呈黃褐色。脾臟血管淤血，色澤變黑。腎腫大表面出血切面皮質(zhì)出血、水腫；髓質(zhì)淤血水腫。心壁血管淤血，會厭軟骨有出血斑。氣管粘膜有彌漫性的針尖大小的出血點、肺氣腫、有出血和淤血斑。肺門淋巴結(jié)淤血，腫大。

本實驗旨在對西藏林芝地區(qū)8 個不同樣本的豬大腸桿菌的培養(yǎng)進行探討，目的在于揭示了林芝地區(qū)的不同豬大腸桿菌病的特性，為該病的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

分別采自西藏林芝地區(qū)豬源大腸桿菌的8 個不同樣本進行分離與鑒定以及藥敏試驗。

（二）培養(yǎng)基

普通瓊脂（普通肉湯）、營養(yǎng)瓊脂，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基.

（三）實驗儀器

培養(yǎng)箱、超凈工作臺、-80℃冷凍箱，-20℃冷凍箱、4℃的冷藏箱、酒精棉球、培養(yǎng)皿、試管、三角瓶，量筒、高壓滅菌鍋、顯微鏡、酒精燈、記號筆、煮沸鍋、手套

（四）試驗藥品

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基（均購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司）；

普通肉湯、革蘭氏染色液（購自杭州天河微生物試劑有限公司）,按說明書配制。

二、方法

（一）實驗方法

1.培養(yǎng)基的制備

按蛋白胨10g、氯化鈉5g、牛肉浸膏10g、磷酸氫二鉀2.5g、蒸餾水1000mL 的比例加入燒杯中，加熱溶解，并用玻璃棒進行攪拌，煮沸后用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 為7.4 到7.6，并繼續(xù)煮沸10min,補足失去水分，濾紙過濾后分裝，經(jīng)121℃滅菌30min，做無菌檢驗和4℃貯存?zhèn)溆?。在制?%蛋白胨牦牛肉湯的制備。滅菌后倒瓊脂平板，待凝固后，置37℃培養(yǎng)24h做無菌檢驗。

2.細菌的形態(tài)學(xué)觀察

選取單個典型菌落進行純培養(yǎng)，并對其進行革蘭氏染色，先用接種環(huán)挑去無菌生理鹽水滴一滴于載玻片上，再跳去單個菌落與生理鹽水混合，待自然干燥后用火焰固定，在玻片上滴結(jié)晶紫染色液進行初染，1～2min 后水洗，加革蘭氏碘液于玻片上媒染，2～3min 后水洗，再加95%酒精脫色，30s 后水洗，最后加番紅復(fù)染液復(fù)染30s～1min 后水洗，自然干燥后鏡檢，觀察細菌染色與形態(tài)。并挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，并4℃保存，備用。

三、分離與鑒定

（一）劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h 后，可由一個細菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代。其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1 次平行劃線 3～5 條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1 次劃線部分作第2 次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細菌污染環(huán)境和操作者。

（二）涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20 個以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。細菌的兩種分離法各有優(yōu)點都可采用。

四、結(jié)果

（一）分離與培養(yǎng)結(jié)果

1.普通瓊脂培養(yǎng)基

在普通瓊脂平板上為光滑菌落，表現(xiàn)為圓形，稍隆起，表面光滑并具有光澤，邊緣整齊，無色或近于灰白色，不透明或半透明，直徑為2mm～3mm。

2.麥康凱培養(yǎng)基

在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性為中等大小、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑濕潤的粉紅色菌落。

3.伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基

分離菌株在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性為中等大小、凸起、邊緣整齊、形成黑色帶金屬光澤的圓形菌落。

五、討論

大腸桿菌病是由病原大腸桿菌引起的細菌性人畜共患病。多種類型疾病的總稱，病原性大腸桿菌一般以O(shè) 抗原進行。豬大腸桿菌病是目前西藏豬生產(chǎn)的主要疾病之一，它流行范圍大，發(fā)病率高，致死率強，臨床上以高熱、呼氣困難、排水樣或血色糞便、間進性消瘦和死亡特征，以及性出血性腸炎典型病理變化，大腸桿菌病是豬的重要傳染病，給豬接種大腸肝菌病苗，預(yù)防該病就顯得十分重要。病理變化一般為解剖檢自然病死豬，可見舌頭突出、皮下血管充血、淤血。主要病變急性出血腸炎，小腸漿膜毛細血管淤血、出血，腸管內(nèi)充充滿血性粘液。小腸粘膜水腫，腹腔積液，腸與瘤胃黏連在一起。腸系膜淋巴結(jié)腫脹，外觀和切面成黑色。肝小葉出血，肝臟腫大呈土黃色。膽囊嚴(yán)重腫大，膽囊壁增厚，膽汁渾濁呈黃褐色。脾臟血管淤血，色澤變黑。腎腫大表面出血切面皮質(zhì)出血、水腫；髓質(zhì)淤血水腫。心壁血管淤血，會厭軟骨有出血斑。氣管粘膜有彌漫性的針尖大小的出血點、肺氣腫、有出血和淤血斑。肺門淋巴結(jié)淤血，腫大。

本實驗旨在對西藏林芝地區(qū)8 個不同樣本的豬大腸桿菌的培養(yǎng)進行探討，目的在于揭示了林芝地區(qū)的不同豬大腸桿菌病的特性，為該病的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)

大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢。主要生活在大腸內(nèi)。

1.大腸桿菌是細菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細胞壁，只含有核糖體簡單的細胞器，沒有細胞核有擬核；細胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運載體。

2.大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。

3.人體與大腸桿菌的關(guān)系：在不致病的情況下（正常狀況下），可認為是互利共生（一般高中階段認為是這種關(guān)系）；在致病的情況下，可認為是寄生。

4.在培養(yǎng)基培養(yǎng)時無需添加生長因子，向培養(yǎng)基中加入伊紅美藍遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。

5.大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系。

6.在普通瓊脂平板上為光滑菌落，表現(xiàn)為圓形，稍隆起，表面光滑并有光澤，邊緣整齊，無色或近于灰白色，不透明或半透明，直徑約2mm～3mm。

7.在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性為中等大小，圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑濕潤的粉紅色菌落。

8.在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性為中等大小、凸起、邊緣整齊、形成黑色帶金屬光澤的圓形菌落。