水質在線生物監測技術研究進展

何 蕾，韓施悅，黃啟慧，夏威林，謝健強，陳立斌

(長江大學 資源與環境學院，湖北 武漢 430100)

1 引言

水是人類生存和發展必不可缺的重要資源之一。工業的高速發展及人類生活生產活動給水環境帶來了各種污染問題[1]。目前我國大陸地區的水體普遍受到了持續性的污染且污染狀況日趨嚴重，尤其是近年來頻發的突發性水體污染事故，嚴重威脅到了當地居民的用水安全，不僅對人群的身心健康產生威脅還對當地的生態環境造成了嚴重的破壞[2]。此外，突發性水體污染也會給水產養殖行業帶來巨大的經濟損失，嚴重影響了社會安定和秩序[3]；例如廣西壯族自治區龍江河曾經的鎘污染突發事件[4]，峰值時鎘濃度值超標約62倍；四川省彭州市的柴油泄漏事件造成下游地區供水中斷，在當地造成嚴重的不良影響；吉林松花江苯類物質(苯、硝基苯等)污染事件，造成了江水嚴重污染，沿岸數百萬居民的生活受到巨大的影響。

大量的污染物在較短的時間內進入水體并對水環境造成嚴重危害的污染事件，是水體突發性污染事件，污染物在水體中擴散很快，因此水體突發性污染事件通常發生非常迅速且難以辨別具體的污染物質[5]。由于污染物排放沒有固定的時間、方式和途徑，污染物在水中擴散極快且會隨著水體流動而擴大影響范圍，所以在水體突發性污染事件中是難以確定排放的污染物類型的，這就加大了我們對污染事故的應急處理難度[6]。因此，充分了解水質在線生物監測預警系統的發展現狀，建立更完善的監測預警系統，利用更科學、有效的監測手段來實時在線監測水質已成為水體污染監測和評價的重要措施[7]，從而達到對水體突發污染事件的及時預警的目的。

常用的監測手段有物理監測、化學監測和生物監測。其中物理監測和化學監測通常是對水體理化性質的監測，如溫度、色度、濁度、pH、懸浮物、溶解氧、化學需氧量、生化需氧量、有毒重金屬和有機農藥等，這種傳統的監測方式多由人工攜帶便攜式監測儀器現場監測或是由固定站點連續監測，成本高，所得到的結果遠遠滯后于水體的變化情況，且往往是反映某單一指標的變化狀況，不能全面地反映水質各方面指標的變化狀況[6，8]。目前的生物在線監測技術的建立主要依賴于水生生物對有害污染物的不同毒理學反應參數，監測水生生物的生理或行為的改變，通過收集、整合、分析和傳輸數據對水體可能發生的污染提供快速并且準確的警報，從而可以在突發性水體污染事件發生的時候，及時發出預警[9]，同時它的預警范圍相較于傳統的監測方式更廣，不僅可以用來判定和評價單一污染化學物質，還可以用來直接判定多種混合化學物質或復雜的工業廢水的綜合毒性[6，10，11]。在實際應用中，水體的毒性效應是一項包含多種指標的生物學參數，是所組成物質拮抗作用或抑制作用的綜合結果[12]。當前用于水體毒性測試的生物學方法主要有發光細菌法、藻類法、魚類法、貝類法、蚤類法、電化學活性微生物法以及多種生物聯合法等[13]，這些方法因其生物特性、生存環境以及個體或群體行為等條件的不同，其操作的復雜程度及實用性等效果也有所不同[14]。

本文綜述了國內外采用不同生物作為受試生物的生物在線水質監測預警的研究發展進程及其優缺點，為生物水質監測預警技術的研究和發展提供參考。

2 以魚類為受試生物進行水質監測預警的研究進展

魚類是較早被作為生物在線水質預警的生物指示種。1929年國外開始出現利用魚類死亡率或其呼吸變化為監測指標的魚類在線監測系統，與此同時，以魚類的正趨運動、回避行為、耗氧率等為指標的生物監測儀器也開始大量出現[15，16]。早期的魚類水質監測主要針對生物器官、個體、群落、系統的變化進行統計觀察，其實驗對象是較大型的藍鰓太陽魚、虹鱒等，所需的試驗場地、試驗藥劑以及對污染物的敏感性都具有一定的局限性。其中，藍鰓太陽魚作為溫水性中小型魚類，生長適溫范圍廣，對水體中的重金屬、有機溶劑及殺蟲劑能比虹鱒做出更迅速、更精準的生理反應，除此之外，藍鰓太陽魚對其它類型的污染物的反應程度的生理反應明顯下降[17]。后期對孔雀魚、劍尾魚、斑馬魚等小型魚類進行水質監測預警的方法隨著水質在線監測預警技術的持續發展不斷衍生[6，18]。20世紀70年代以后，斑馬魚開始受到眾多環境毒理學家的高度重視。隨著人們的研究發現，斑馬魚有體型小、繁殖快、生活場地小、成本低且具有與人類類似的基因組成等優勢，這使其成為專家們進行有毒物質脅迫下的急性毒性試驗研究以及污染物的積累效應研究的重點試驗對象[19～23]。

隨著魚類監測技術的發展，國內外出現了大量的魚類監測模型及系統。一種基于Light GBM模型的魚類異常行為的檢測技術隨之誕生，其精度高、占用內存少、運算速度快、準確率高、支持并行化學習、可處理大規模數據，因而在魚類監測方面逐漸得到廣泛應用。有研究表明，有效的特征提取可以提高魚類異常行為檢測的精確度，但自然條件下水質環境較為復雜，易產生其它因素干擾。因此為進一步提高模型的魯棒性，即在異常和危險情況下系統正常運行的能力，實際應用還需要考慮魚類行為的其他特征(如運動加速度、游動軌跡)[24]。其次是利用計算機視覺技術監測魚的活動電位變化、應激行為等指標[25～27]，以魚類活動電位的功率頻譜密度測量取代電壓測量[28]。此方法將魚類活動電位按照不同的運動方式的相應的頻率分為呼吸電位頻率和游泳電位頻率，通過對呼吸電位頻率和游泳電位頻率的共同數值監測得來的水質數據能夠涵蓋更大范圍的污染物濃度，即提高了單一監測系統對水中毒物的敏感度；除此以外，加上讀取呼吸運動所占的功率和游泳運動所占的功率在總運動功率中的各占的比例能在進一步提高單一監測系統對水中毒物的敏感度的基礎上消除由于魚類的個體行為、生理差異等帶來的監測誤差，進一步提高了系統的精確度。盡管將魚類活動電位按照不同的運動方式相應的頻率來監測提高了相應的精確度，但目前以魚類活動電位的功率頻譜密度測量取代電壓測量的方法只能對毒性較強的污染物例如氰化物、硫化物等進行水質監測，而為了將該方法應用于大多數情況即證明任何實際情況下實驗判據選擇的合理性以及整個系統的靈敏性，該方法還需要和目前國際先進的毒物監測系統(如德國的MFB等)進行所用毒物的濃度以及檢測所需時間的對比[28]。除上述技術外，魚類監測技術還有基于卡爾曼濾波的魚群三維跟蹤算法技術[29]、基于視覺化的計算機監測系統分析斑馬魚的應激行為并運用RGB顏色空間下的紅藍分量差分法實現運動目標監測技術[24]和以魚死亡為終點的應急監測技術[30]等。

魚類作為最古老的脊椎動物，又是水生態系統中的頂極群落，在環境因子的影響下，魚類不僅能夠反映各類污染物對水中生物不同程度的影響，也能直接反映污染物對魚類所處的環境脅迫影響，由此，魚類常被作為水體環境狀況的指示生物[17]。監測項目中利用到了魚類的回避反應等，用于監測的參數則包括魚類的活動規律、呼吸行為和放電行為等，監測指標各異，數據處理較為繁瑣復雜，且不及時處理死亡的受試生物會進一步加劇監測水體的污染，使附加成本大幅提高[31]。另外，使用魚類進行水質在線監測的儀器及魚苗供應商能夠保證監測項目的正常開始，但隨著實驗的進程，魚類在生長的過程中出現的各類問題需要一定的魚類養護技術和經驗才能保證項目的順利進行，人力成本也隨之增加。

3 以發光細菌為受試生物進行水質監測預警的研究進展

細菌毒性監測技術采用的菌種通常有發光異短桿菌、明亮發光桿菌、費氏弧菌、青?；【?、羽田希瓦氏菌[32]等，而在對亞鐵硫桿菌法、硝化細菌法和發光細菌法在內的多種細菌生物毒性監測方法中，發光細菌法有著更明顯的優勢且應用更為廣泛，在衛生、環保、疾控領域都有大規模的應用[33，34]。發光細菌是一種非致病的革蘭氏陰性厭氧細菌。發光細菌在正常的生理條件下能夠發射波長在450～490 nm的藍綠色可見熒光。當與外來有毒污染物質接觸時，其新陳代謝會受到影響，根據污染物性質和毒性的不同發光強度會減弱甚至熄滅[35]。在1672年發現發光細菌的發光受化學物質抑制這一現象以后，有學者在1976年發現并闡明了有機物對發光細菌的發光抑制效應以及毒性作用機制，之后相繼衍生出的生物毒性測試系統、便攜式毒性測定儀等監測系統或監測儀器都促進了生物毒性監測的發展。其中基于費氏弧菌的常用監測儀器型號有荷蘭TOXcontrol、美國US Almightier和深圳朗石Lumifox8000[36，37]等,而英國的AMTOX檢測儀和日本的固定化菌膜傳感器[38]則是基于硝化細菌對有毒物質的反應的監測儀器。用于環境毒物監測的發光細菌法起源于20世紀80年代，它通過光電檢測系統測試發光細菌的發光強度，在特定范圍內有毒物濃度的高低與發光細菌的發光強度的強弱呈劑量-效應關系[32，39，40]，因此可根據發光細菌的發光強度大小與有毒物濃度呈負相關關系這一規律來推算出毒物濃度[14，19，32，41，42]。1995年我國頒布應用發光細菌進行水質毒性測試的標準以后，大量學者開始研究重金屬、有機溶劑、除草劑等不同種類的污染物對發光細菌的毒性評價，研究發光細菌的最佳測試條件以及其與污染物的相關性等。

發光細菌生物監測技術的設備操作簡單、具有較好的可擴展性，在國內外的飲用水安全、食品飲料安全及水質污染監測預警等領域應用十分廣泛。此外，發光細菌法有國際標準(ISO 11348-3-1998)和國內標準(GB/T15441-1995)支持，其評價指標及體系也具有較大的權威性[14，34，42，43]。但是由于發光細菌需要定期更換菌種，維護周期較短(一般為1～2周一次)，因此運營成本也較高[32，34]。發光細菌生物毒性監測技術具有可進行應急檢測、檢測時間短以及檢測譜寬的特點。但是發光菌種的生物毒性有效期較短，不適合用于較長時間段的全自動監測。目前我國大多數水質檢測都是實驗室內指標的檢測，而在自然環境中運用的更廣的生物毒性的檢測還處在發展階段，需要進一步研究。此外，發光細菌的生物毒性監測儀器的成本較高且需考慮水體內營養物質對監測結果的影響也是其需要格外注意及改進的部分。

4 以藻類為受試生物進行水質監測預警的研究進展

藻類是一類通過細胞營養性分裂，或借助于單細胞的孢子、合子的方式進行生長繁殖的懸浮生活在水中的水生生物，其群落結構特征被廣泛應用于評價和監測水質[44，45]。藻類常被用作化學品毒性測試，特別是重金屬離子的毒性測試的指示物種。常用的藻類監測系統有德國bbe公司藻類在線水體生態毒性檢測系統(A-Tox)和藻類在線熒光檢測系統[46，47]等。其中Algae Toximeter[46]是一種對水體中藻類新陳代謝導致的葉綠素含量熒光光譜和熒光動力變化在線分析的系統，該系統對除草劑尤為敏感，它將標準化培養的藻類自動加入受測水體中，實時監測其葉綠素濃度的變化，當水質發生變化的時候，產生的環境脅迫會降低藻類的新陳代謝使其葉綠素水平降低，激發系統警報。該系統裝置不需要進行特殊的管理，受試生物的更換周期為7d，并且可以進行自動清洗，進行24 h不間斷的監測，通過電腦或手機遠程監控，斷電后再通電也可正常運行，但其不能反映污染物的濃度與種類，只能起預警的作用；而應用的最典型的技術則是光電子技術，藻類分析法以水藻作為探測生物，利用葉綠素熒光技術連續檢測被測水樣，一旦有毒物質進入水體，受到毒性作用的藻類的光合作用強度減弱、活性降低，平行對比正常生理條件下藻類光合作用的活性，根據兩者的差異得知污染物毒性的強弱；以此技術為基礎的藻類在線檢測儀，可以快速測得葉綠素熒光值與葉綠素濃a濃度、細胞密度的相關性等，因為不同藻類對設定波長的激發光所響應的熒光光譜不同，根據測得的熒光光譜及其強度，對藻類進行分類和定量檢測，獲得水環境實時監測數據，為災害性事故和水華的發生做出預判[47,48]。此外，用于檢測水質的方法還有通過生物催化劑的發光和真核藻類氧氣的產生量測定光合作用行為的強弱，或對比藻類細胞(如單細胞鞭毛眼蟲藻)的活動或其游走孢子(如石莼)的釋放規律[42，49,50]。

藻類對除草劑類的農藥、重金屬等較為敏感，并且有國際標準ISO8692支持，但是藻類對殺蟲劑的敏感度較低，且不穩定、受基準藻培養質量影響較大[43]。此外，以藻類為探測生物的儀器，通常都會選擇培養馴化當地物種，需要一定的馴化技術和培養經驗，且藻類更換較為頻繁[50]。

5 以貝類為受試生物進行水質監測預警的研究進展

早期美國有學者將淡水蚌作為受試生物對碳氫化合物、放射性元素、金屬穩定同位素等污染物進行監測，之后科學家發明了通過電磁感應技術來感應殼瓣運動的監測系統[51]。英國、美國、法國和澳大利亞等國家則利用牡蠣和貽貝監測水質變化[52,56]。貝類在水體中通過過濾水體中的藻類等微型生物吸取營養來生長繁殖，它在不利環境下會產生緊閉外殼的現象來排除外界刺激物。在水體被污染的情況下，貝類的運動狀況會因污染物的種類和濃度不同而受到不同程度的影響。因此，貝類動物生物毒性監測技術通常利用貝類動物的防衛機能即貝類遇到外界刺激時會發生閉殼反應來監測水質毒性[18，41，50，57]。目前常用的貝類監測生物有斑貽貝、普通貽貝、河蚌、珠蚌、食用牡蠣等[11，58～61]。

貝類對重金屬、農藥較敏感，但是相應的標準生物物種較少，可供選擇的探測生物種類范圍較小[43]。相比于其他探測生物而言，采用貝類作為受試生物時通常選用當地物種，所以使用和購買都較為便利。此外，貝類生存能力較強，其更換周期相比于其他傳統受試生物會較長一些[50]，考慮到其個體較大、所需檢測時間較長且個體差異對監測結果影響大等原因，可能存在靈敏度低等缺點。

6 以蚤類為受試生物進行水質監測預警的研究進展

水蚤作為一種受試生物，在生物毒性監測方面取得了一定進展，它對多種有毒物質都很敏感，具有良好的重現性，是國際公認的一種標準毒性實驗生物[58，62]。利用蚤類在受污染環境中的游動速度、高度以及運動軌跡，分析它在該環境中的形態、生理和行為的變化，可以對水體毒性進行初步判斷，為水質在線生物監測預警提供實驗基礎[19，42,43，50]。蚤類中用于毒性研究最多的是大型溞，利用其體內酶活性的變化可以更早地檢測出污染物的存在，有利于我們提前對受污染水體進行控制，抑制污染物的擴散[63]。在水蚤用于環境監測的評價指標分析中，通過研究水體富營養化對隆線溞的影響，發現隆線溞體內的乙酰膽堿酯酶的活性隨受污染水體中三唑磷含量的增加而降低。另外，在研究重金屬鎘和鋅的聯合毒性作用時發現，蚤類體內的MT含量隨鎘和鋅的聯合濃度的升高呈現先上升后下降的趨勢，在較低濃度時表現為協同作用，在中等濃度時表現為相加作用，在較高濃度時表現為拮抗作用，由此可知蚤類體內的MT物質可作為鎘、鋅聯合毒性評價的敏感指標[64]。

蚤類的體積小、易觀察、易培養且發生率高、繁殖周期短、對污染物敏感，具有良好的重現性[65]。此外，蚤類對殺蟲劑敏感度較高，但是對除草劑敏感度低，且缺少標準毒理試驗的標準方法[66]。在水蚤監測水質的實驗中，通過分析水蚤在受污染環境中的繁殖率及死亡率可以得到較直觀的實驗結果，但測試的靈敏度、實驗數據的準確性和可比性都會受到水蚤種類和年齡的影響，為此，需要對進行測試的水蚤的基因型、投喂的食物和水蚤培養所需的外界環境因素進行標準化的限定[64]。此外，以蚤類為探測生物的儀器通常存在誤報警率高、維護難度大以及生物更換頻繁等缺點。

7 以電化學活性微生物為受試生物進行水質監測預警的研究進展

目前用作毒性監測的生物傳感器有DNA傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器和酶傳感器。以電化學活性微生物為受試生物通常采用的是微生物傳感器法。微生物傳感器法包括固定化微生物、換能器和信號輸出裝置三部分，微生物活體是作為分子識別固定于電機表面的敏感材料的一種生物傳感器，由于微生物本身包含多種酶系，利用其體內的各種酶系及代謝系統來檢測和識別相應底物，就可以達到測試有毒物質綜合毒性的目的。常見的生物活體包括細菌、真菌、酵母菌和動物細胞等[42]。目前已有的監測系統有美國喬治亞理工大學采用的利用中紅外區域光纖消逝光譜測量待測微生物與對應標記物的相互作用的生物光電傳感器系統[67]。系統的傳感區域涂有特定的薄聚合物層形成疏水膜，可使疏水性分析物在傳感器附近富集，減少對基質的干擾。該傳感器能快速并實時測量且具有高靈敏度，不需要額外的步驟或消耗性試劑，并能夠檢測水和空氣中各種化學和生物樣本[68]。此外,英國研究國際公司和美國海軍研究實驗室研發的基于光纖的生物傳感技術RAPTOR，是一套便攜式快速自動熒光測定系統。該系統是集流體、光學、軟件和電子于一體的獨立結構，適用于生物毒素、爆炸物、生物和化學污染物的現場檢測和實驗室分析[67]。

以電化學活性微生物為受試生物的微生物傳感器法通常具有靈敏度高、檢測速度快以及操作維護簡單等優點，但是也存在抗干擾能力差以及誤報警率高等缺陷。

8 以多種生物聯合為受試生物進行水質監測預警的研究進展

鑒于生物個體具有生理局限和敏感程度等限制因素，不同種類的水生生物對相同污染水體的響應差別巨大，往往在使用單一生物進行水質監測時容易存在錯誤報警或未及時報警的情況。因此，使用多物種在線預警技術能夠更為全面、準確地反映水體污染事故中不同污染物的危害及其疊加效應，在一定程度上降低監測系統報警的失誤率，還可以考慮到多種污染物造成的水體污染的綜合影響[41,42]。多物種在線生物監測儀可以通過預先設定的方法，采用96種以內的生物種類同時進行水質監測，從而實現對水體內多種不同生物運動行為的在線監測。根據預先設定的各閾值，如果連續3次記錄中的設定頻率偏離正常值的百分率超過了警示閾值，生物監測儀就會發出預警信號，從而達到持續在線監測水質的目的。常見的監測技術有根據水體生物的呼吸頻率監測水體污染的生物早期預警系統BEWs[6，69]以及與BEWs系統相似的運用四級阻抗技術的多物種生物監測儀，其中多物種生物監測儀MFB(Multispecies Freshwater Biomonitor)是一種較成熟的在線監測儀[6，70]。

利用多種生物同時進行水質監測預警，可以持續進行水環境質量的在線監測，幾乎所有能夠對環境脅迫產生行為反應的水生生物都可以用來監測水環境污染和突發性水體污染事故。因此，以多種生物聯合作為探測生物可以極大程度地提高生物水質監測儀器的敏感性和選擇性，降低誤報警率。但由于生物物種過多導致維護成本較高，且需要掌握對不同種生物的觀測分析技術及數據處理方法，因此操作難度較大[32，41]。此外，生物預警雖然可以在發生突發污染事件的時候發出及時的預警，但從定量角度確定污染因子的種類和污染量的能力較弱，但目前尚沒有標準的生物監測體系，對于該領域的技術監督和儀器質檢都還有巨大的發展空間。

9 結論

根據所選擇的作為生物傳感器的探測生物的不同，生物綜合毒性監測設備的優缺點也不同。本文綜述了常見的幾種毒性監測設備的研究現狀及其優缺點，通過對比發現：

(1)以魚類為受試生物的監測系統可監測的污染范圍較小，且設備維護成本較高；以發光細菌為受試生物的監測系統，不適用于較長時間段的全自動監測，且成本高、需定期更換菌種、維護周期較短；以藻類為受試生物的監測系統，對馴化人員的技術要求較高，對殺蟲劑敏感度較低且不穩定，更換受試生物也較為頻繁；以蚤類為受試生物的監測系統，對除草劑的敏感度低，需要頻繁地更換受試生物，誤報警率高、維護難度大；以電化學活性微生物為受試生物的監測系統，抗干擾能力差、誤報警率高。

(2)以貝類為受試生物的監測系統，對重金屬和農藥等常見的生活及工業污染物都較敏感，能對自然水體水質的毒性變化進行中長期監測預警。另外，其使用和購買較便利、成本低、對個體發育程度要求不高、運動范圍小、易于觀察、更換周期長、不需要額外投喂食物、生存能力強、適應范圍廣、簡單易行、在各個湖泊、水庫以及河流流速較緩的水域都可利用現有的無線信號裝置實現在線監測。

(3)目前懸浮式貝類生物監測預警系統還處于萌芽階段，以貝類為受試生物的監測預警具有較大的發展前景。