滇重樓內生真菌次生代謝產物研究

牛德云，李吉玲

(1.云南警官學院，云南 昆明 650233；2.昆明市第一人民醫院，云南 昆明 650034)

1 引言

滇重樓主要分布于云貴川三省，而盛產于云南，生長在海拔較高的山區闊葉林、坡地、松林中。滇重樓自古以來就是民間重要的草藥，也是著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊等藥品的主要原料[1,2]。近年來，隨著新型中成藥市場的開拓，對重樓原材料的需求量逐年劇增，傳統重樓種植已經滿足不了市場的需求。研究者們另辟蹊徑，轉為研究重樓內生菌代謝產物來應對中藥材資源短缺的問題，滇重樓內生菌分為內生真菌和內生細菌，這些內生菌通過寄生的方式產生各類活性成分，如抑制其他微生物活性、抗腫瘤細胞活性等作用[3]。另外，滇重樓內生菌的代謝產物對抑菌、鎮靜鎮痛、抗細胞毒素有一定作用，臨床上還嘗試用于治療部分腫瘤，具有顯著的療效[4,5]。

目前對滇重樓內生真菌代謝產物的研究居多，通過研究其代謝產物，分離鑒定出大批活性物質，其中口山酮類化合物是其中的一種，課題組前期對一株滇重樓內生真菌(與本研究所選菌株YNCY0884屬同一批次分離鑒定所得)代謝產物進行了研究，分離得到多個口山酮類化合物，這些化合物在本次所選菌株的代謝產物中也出現，說明同一植物的不同內生真菌代謝產物有一定的相似性。

本文旨在發現滇重樓內生真菌代謝產物中口山酮類化合物，對比前期研究過的同一批次分離所得的菌株代謝產物，結果發現兩者代謝產物中均存在口山酮類化合物，前期對口山酮類新化合物做細胞毒活性檢測，結果表明該類物質具有良好的活性。鑒于此，為進一步深入研究該類物質，挖掘其背后的藥用信息，本研究有針對性的開展分離工作，初步分離便獲得目標化合物，預計下一步的分離中會發現新穎口山酮類化合物。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

紫外分光光度計 (Spectrumlab 24)，紅外分光光度計 (Bio-Rad FTS-135)，旋光儀 (JASCO DIP-370)，半制備高效液相色 (Agilent-1200)，旋轉蒸發儀 (EYELA-N-1100D)，核磁共振儀 (Bruker AM-500)，質譜儀(VG AUTO Spec-3000)，半制備色譜柱 (Venusil XBP-C18) ，LDZX-40B1型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，隔水式恒溫培養箱(上海恒科學儀器有限公司)，LRH-150-G光照培養箱(廣東省醫療器械廠)，LRH-250-G光照培養箱(廣東省醫療器械廠)，ZHWY-2102恒溫培養振蕩器(上海智成分析儀器制造有限公司)，恒溫搖床，超凈工作臺，500 mL罐裝瓶, 電子天平。

2.2 材料

菌株經鑒定為滇重樓內生真菌，菌株編號為YNCY0884。菌株篩選完成后進行培養，然后進行放大發酵。

2.3 提取和分離

固體發酵產物收集于50 L工業塑料桶中，用大于提取物2.5倍質量的工業乙醇浸泡3～5 d，超聲處理3次，濃縮除去乙醇，共提取3次，合并提取液并濃縮；所得濃縮產物用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相減壓濃縮得到浸膏。所得浸膏520g，浸膏用甲醇溶解后用硅膠拌樣，樣品裝填大型硅膠(100-200目)柱層析初分劃段，用不同比例的氯仿-甲醇流動相分為6個極性段 20∶1(Ⅰ)、9∶1(Ⅱ)、4∶1(Ⅲ)、7∶3(Ⅳ)、3∶2(Ⅴ)、1∶1(Ⅵ))。

用前期分離完成的一個菌株的目標單體化合物為對照，經TLC監測發現口山酮化合物主要分布于Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三個組分。選取Ⅱ、Ⅳ組分分別經甲醇溶解，采用0.45 μm 微孔過濾膜過濾后，用C18反相柱，以 60% (乙腈：水)作流動相，流速為 3 mL/min分別劃分為6段和4段。用半制備高效液相對劃分后的Ⅱ、Ⅳ段組分進行細分、純化得到化合物1(15.2 mg)、化合物2(10.4 mg)、化合物3(9.6 mg)、化合物4(20.4 mg)、化合物5(7.6 mg)、化合物6(14.8 mg)、化合物7(17.1 mg)、化合物8(6.7 mg)、化合物9(9.8 mg)、化合物10(25.4 mg)、化合物11(10.3 mg)、化合物12(19.6 mg)。

3 化合物結構鑒定

化合物1,C18H16O8；黃色膠體;ESIMS m/z(positive ion mode)383 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm:6.69(1H,s,h-2),7.28(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),7.70(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),2.58(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.64(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),3.82(3H,s,1-OMe),4.12(3H,s,3′-OMe),12.29(1H,s,Ar-OH-4),12.67(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 154.0(s,C-1),107.0(d,C-2),140.0(s,C-3),140.2(s,C-4),156.8(s,C-5),120.9(d,C-6),124.9(d,C-7),127.0(s,C-8),182.0(s,C-9),146.3(s,C-4a),120.3(s,C-8a),110.0(s,C-9a),148.5(s,C-10a),37.3(t,C-1′),64.0(t,C-2′),170.0(s,C-3′),60.0(s,1-OMe),52.2(q,3′-OMe).以上數據與文獻[6]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為4,5-二羥基-3-羥乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮。

化合物2,C16H14O6; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 325 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.39(1H,d,J=8.3 Hz,H-6),6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.62(1H,d,J=8.3 Hz,H-7),6.65(1H,s,H-2),3.54(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.60(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.96(3H,s,1-OMe),13.75(1H,s,Ar-OH-8),12.68(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 163.2(s,C-1),99.4(d,C-2),161.5(s,C-3),109.8(s,C-4),110.9(d,C-5),137.2(d,C-6),107.5(d,C-7),162.9(s,C-8),181.8(s,C-9),155.8(s,C-4a),108.7(s,C-8a),104.6(s,C-9a),158.3(s,C-10a),34.8(t,C-1′),64.5(t,C-2′),56.2(s,1-OMe)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1,8-二羥基-4-羥乙基-3-甲氧基口山酮。

化合物3,C17H14O7;黃色膠體；ESIMS m/z (positive ion mode) 353 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.57(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.55(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.32(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.21(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.75(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.45(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.27(3H,s,3′-OMe),12.46(1H,s,Ar-OH-5),12.46(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 164.2(s,C-1),107.5(d,C-2),148.6(s,C-3),104.5(d,C-4),155.0(s,C-5),120.0(s,C-6),125.4(d,C-7),120.8(d,C-8),181.8(s,C-9),156.2(s,C-4a),124.4(s,C-8a),118.3(s,C-9a),152.6(s,C-10a),36.4(t,C-1′),63.6(t,C-2′),168.2(s,C-3′),52.4(s,3′-OMe)。以上數據與文獻[8]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1,5-二羥基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物4,C18H16O7；黃色膠體,ESIMS m/z367.0802[M+Na]+(calcdC18H16NaO7for367.0794);1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.72(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.63(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.46(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.82(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.67(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.23(3H,s,3′-OMe),3.75(3H,s,1-OMe),12.75(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 164.1(s,C-1),107.0(d,C-2),148.5(s,C-3),104.2(d,C-4),154.7(s,C-5),119.0(s,C-6),126.0(d,C-7),120.0(d,C-8),182.8(s,C-9),155.4(s,C-4a),124.6(s,C-8a),118.0(s,C-9a),152.8(s,C-10a),36.0(t,C-1′),63.8(t,C-2′),168.0(s,C-3′),56.0(q,1-OMe),52.8(q,3′-OMe)。以上數據與文獻[8]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-5-甲氧基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物5,C17H14O6；黃色膠體,ESIMS m/z (positive ion mode) 337 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.84(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.62(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.22(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.09(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.69(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.68(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.14(3H,s,3′-OMe),12.41(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 161.9(s,C-1),109.5(d,C-2),148.7(s,C-3),104.4(d,C-4),119.5(d,C-5),130.6(d,C-6),122.7(d,C-7),134.6(s,C-8),181.9(s,C-9),156.8(s,C-4a),117.9(s,C-8a),109.0(s,C-9a),154.9(s,C-10a),36.7(t,C-1′),64.2(t,C-2′),170.3(s,C-3′),53.4(q,3′-OMe)。以上數據與文獻[8]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-3-羥乙基-8-甲酯基口山酮。

化合物6,C18H14O6；黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 365 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.51(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.00(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.98(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),1.38(3H,s,H-3′),2.47(2H,s,H-1′),4.43(3H,s,4′-OMe),12.62(1H,s,Ar-OH-5),12.09(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),108.8(d,C-2),144.5(s,C-3),106.2(d,C-4),155.0(s,C-5),119.0(s,C-6),126.4(d,C-7),120.0(d,C-8),182.0(s,C-9),156.6(s,C-4a),125.0(s,C-8a),119.0(s,C-9a),152.0(s,C-10a),49.0(t,C-1′),205.9(s,C-2′),30.4(q,C-3′),169.2(s,C-4′),52.1(q,4′-OMe)。以上數據與文獻[9]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1,5-二羥基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基口山酮。

化合物7,C18H14O6; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 353[M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.69(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.56(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.43(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.09(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.89(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),2.24(2H,s,H-1′),1.46(3H,s,H-3′),4.24(3H,q,4′-OMe),12.36(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.0(s,C-1),110.2(d,C-2),144.1(s,C-3),105.9(d,C-4),120.2(d,C-5),130.1(d,C-6),122.0(d,C-7),133.9(s,C-8),180.0(s,C-9),157.0(s,C-4a),116.9(s,C-8a),108.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),50.1(t,C-1′),206.0(s,C-2′),30.5(q,C-3′),170.2(s,C-4′),53.0(q,4′-OMe)。以上數據與文獻[9]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮。

化合物8,C18H18O9;黃色膠體,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.33(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.62(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.42(1H,s,H-2),4.53(1H,m,H-2′),4.20,4.30(2H,m,H-4′),3.91(1H,m,H-1′),3.39,3.42(2H,m,H-3′),3.89(3H,s,OMe-3);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 155.4(s,C-1),100.1(d,C-2),160.2(s,C-3),130.0(s,C-4),123.1(s,C-5),135.0(d,C-6),110.1(d,C-7),161.9(s,C-8),181.9(s,C-9),153.1(s,C-4a),109.8(s,C-8a),106.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),43.1(d,C-1′),73.5(d,C-2′),69.3(t,C-3′),63.5(t,C-4′),56.4(q,OMe-3)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1,4,8-三羥基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物9,C18H18O9；黃色膠體,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1HNMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.52(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.95(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.53(1H,s,H-2),4.84(1H,m,H-2′),4.19,4.36(2H,m,H-4′),4.20(1H,m,H-1′),3.46,3.51(2H,m,H-3′),3.83(3H,s,OMe-3),14.27(1H,s,Ar-OH-4),13.94(1H,s,Ar-OH-1),13.73(1H,s,Ar-OH-3);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 156.2(s,C-1),101.2(d,C-2),157.3(s,C-3),131.2(s,C-4),121.0(s,C-5),135.0(d,C-6),106.9(d,C-7),166.2(s,C-8),182.1(s,C-9),153.2(s,C-4a),111.2(s,C-8a),106.1(s,C-9a),156.2(s,C-10a),42.3(d,C-1′),73.1(d,C-2′),66.2(t,C-3′),61.0(t,C-4′),60.9(q,OMe-8)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1,3,4-三羥基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物10,C20H20O9; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 427 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 6.89(1H,s,H-4),6.76(1H,s,H-5),6.72(1H,s,H-7),6.64(1H,s,H-2),5.13(1H,m,H-2′),4.54,4.59(2H,m,H-3′),4.40(1H,m,H-1′),4.10,4.21(2H,m,H-4′),3.78(3H,s,OMe-1),4.3(3H,s,OMe-5′),12.79(1H,s,Ar-OH-6);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),109.0(d,C-2),150.2(s,C-3),104.4(d,C-4),103.8(d,C-5),165.6(s,C-6),114.1(d,C-7),137.5(s,C-8),182.4(s,C-9),156.4(s,C-4a),110.2(s,C-8a),108.2(s,C-9a),159.1(s,C-10a),42.8(d,C-1′),72.9(d,C-2′),67.1(t,C-3′),63.4(t,C-4′),170.2(s,C-5′),56.3(q,OMe-1),53.0(q,OMe-5′)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為6-羥基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物11,C21H22O10;黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.32(1H,s,H-7),6.98(1H,s,H-4),6.54(1H,s,H-2),5.26(1H,m,H-2′),4.74,4.82(2H,m,H-3′),4.53(1H,m,H-1′),4.21,4.26(2H,m,H-4′),3.80(3H,s,OMe-1),4.2(3H,s,OMe-5′),3.84(3H,s,OMe-6),3.76(3H,s,OMe-5),13.4(1H,s,Ar-OH-1);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 162.2(s,C-1),107.9(d,C-2),148.6(s,C-3),105.8(d,C-4),147.2(s,C-5),152.5(s,C-6),106.4(d,C-7),130.5(s,C-8),182.5(s,C-9),155.2(s,C-4a),111.0(s,C-8a),108.0(s,C-9a),145.5(s,C-10a),42.9(d,C-1′),72.5(d,C-2′),66.2(t,C-3′),63.4(t,C-4′),171.1(s,C-5′),61.0(q,OMe-5),56.5(q,OMe-6),52.8(q,OMe-5′)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物12,C21H22O10;黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.76(1H,d,J=8.8,H-7),7.44(1H,d,J=8.8,H-6),6.82(1H,s,H-2),5.31(1H,m,H-2′),4.64,4.78(2H,m,H-3′),4.39(1H,m,H-1′),4.26,4.18(2H,m,H-4′),3.71(3H,s,OMe-1),3.82(3H,s,OMe-4),4.52(3H,s,OMe-5′),13.17(1H,s,Ar-OH-5);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 155.0(s,C-1),106.4(d,C-2),130.1(s,C-3),145.2(s,C-4),155.0(s,C-5),122.0(d,C-6),125.3(d,C-7),126.0(s,C-8),182.1(s,C-9),147.1(s,C-4a),120.0(s,C-8a),108.2(s,C-9a),148.0(s,C-10a),41.5(d,C-1′),72.8(d,C-2′),66.0(t,C-3′),62.0(t,C-4′),170.1(s,C-5′),56.0(q,OMe-1),61.5(q,OMe-4),53.2(q,OMe-5′)。以上數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故鑒定化合物為5-羥基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

4 結果與討論

(1)從滇重樓內生真菌YNCY0884菌株分離得到12個口山酮類化合物，分別為：4,5-二羥基-3-羥乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮、1,8-二羥基-4-羥乙基-3-甲氧基口山酮、1,5-二羥基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮、1-羥基-5-甲氧基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮、1-羥基-3-羥乙基-8-甲酯基口山酮、1,5-二羥基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基

口山酮、1-羥基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮、1,4,8-三羥基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、1,3,4-三羥基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、6-羥基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、1-羥基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、5-羥基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

(2)從化合物鑒定結果可知滇重樓內生真菌不同菌株中含有相同代謝產物，這可能跟寄生同一宿主有關，相同的宿主植物能為內生菌提供相同的生存環境。

(3)本實驗采取固體發酵，固體發酵具有發酵周期短，代謝物常量高，發酵成本低、易操作等特點。