笠貝(Lottia goshimai)早期發育過程的掃描電鏡觀察*

崔夢露 郇 聘 劉保忠

笠貝()早期發育過程的掃描電鏡觀察*

崔夢露1, 2郇 聘1①劉保忠1

(1. 中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049)

軟體動物的早期發育研究對于理解其發育及演化機制有重要意義。利用掃描電子顯微鏡對笠貝()的早期發育過程進行研究, 結果表明, 笠貝早期發育過程十分迅速, 受精后9 h左右即形成擔輪幼蟲, 在24 h內發育為典型的面盤幼蟲。掃描電鏡下, 可以觀察到原腸作用中很有特色的外包式的細胞運動過程, 并清晰地觀察到前擔輪環、貝殼形成區以及足原基的漸次發育。總體而言, 笠貝的早期發育過程既體現了等裂型軟體動物發育的典型過程(如外包式原腸作用), 又展現出腹足綱動物的種系特異性特點(如貝殼的生長方向)。研究結果可以為深入解析笠貝早期發育機制提供基礎支持。

笠貝; 原腸作用; 貝殼; 足; 前擔輪環

軟體動物(Mollusca)是第一大海洋動物類群, 其身體結構模式存在巨大的多樣性, 典型類群如頭足類(章魚等)、腹足類(螺等)、雙殼類(牡蠣等)等表觀差異很大(Haszprunar, 2012; Wanninger, 2019)。與之相對的是, 軟體動物的早期發育過程十分相似。多數間接發育的軟體動物都有面盤幼蟲階段(veliger), 其中的相當一部分如雙殼類和部分腹足類還共享更早的擔輪幼蟲階段(trochophore)。

除頭足類等特化類型外, 軟體動物胚胎早期發育主要存在兩種模式。在以牡蠣等為代表的物種中, 其前兩次卵裂不對稱, 形成A、B、C、D四個卵裂球, 其中D卵裂球體積最大, 大體對應胚胎背部。而在另外一些動物如笠貝、鮑中, 其前兩次卵裂為均等分裂, 形成的四個卵裂球沒有形態上的差異, 其背腹向的極性要等到第五次卵裂后(32細胞期)才會開始形成。對這類胚胎而言, 接近64細胞期的胚胎才能觀察到背腹方向上的不對稱。研究表明, 雖然發育模式存在差別, 在分子水平上, 兩類胚胎背腹軸的建立依賴相同的信號網絡, MAPK信號通路在其中發揮重要功能(Lambert, 2001; Lambert, 2003)。在背腹極性形成后, 很快開始原腸作用及器官發生等重要的發育事件。由于前期卵裂模式的差異, 兩類胚胎的后續發育也有很大差別。例如雙殼類等不等裂類型的動物中, 原腸作用主要依賴于內胚層細胞的內陷, 細胞運動較少(Kurita, 2009), 而等裂類型胚胎的原腸作用則涉及大量細胞的運動, 體現為外包等形式(Lartillot, 2002)。最終, 通過上述迥異的發育模式, 不同類群的軟體動物均能形成形態和結構均極為相似的擔輪幼蟲。

典型擔輪幼蟲的身體被一個由纖毛組成的前擔輪環(prototroch)分為前后兩部分。前部包括頂纖毛、幼蟲眼等結構, 后部包括了主要的身體結構如位于背側及腹側的貝殼和足原基, 部分類群動物的擔輪幼蟲在身體末端還存在后端纖毛環(telotroch)。許多軟體動物中后端纖毛環可簡化為幾束纖毛, 本文中稱作端纖毛。與其他多數原口動物相同, 神經系統及胚孔(幼蟲口)分布在擔輪幼蟲腹側。擔輪幼蟲時期后, 幼蟲逐漸出現軟體動物門乃至更低級分類階元(綱、亞綱等)特異性的性狀, 如形狀各異的貝殼及足等。軟體動物如何采用不同的策略來發育為擔輪幼蟲, 擔輪幼蟲形成后又如何形成各個類群的獨特特征(lineage-specific characters), 是軟體動物發育生物學研究的重要科學問題。要解答這個問題, 需要對不同類群軟體動物的發育模式開展精細分析, 并在分子和細胞水平開展比較研究。

山東青島沿海分布的笠貝(Nakayama, Sasaki & Nakano, 2017)隸屬于軟體動物門腹足綱, 其發育過程屬于典型的等裂類型, 是研究該類發育模式的理想研究對象。在前面的工作中, 我們研究了其貝殼和足等重要器官的發育過程(譚素建等, 2018; 王倩等, 2019)。本研究基于掃描電子顯微鏡觀察全面分析了笠貝早期發育過程。結果表明, 笠貝的早期發育過程呈現諸多與近緣門類動物可類比的特點, 同時也存在其自身的特殊性, 是發育和演化研究的理想對象。

1 材料與方法

1.1 笠貝采集及幼蟲培養

成體笠貝采集自山東青島沿海。在夏季繁殖期, 采集的成熟親貝可在數小時內產卵排精, 將精卵混合進行人工受精后, 受精卵置于25 °C的海水中恒溫培養。收集不同發育階段胚胎或幼蟲, 利用2.5%戊二醛固定。對于面盤幼蟲, 先使用氯化鎂溶液麻醉后再固定, 以免幼蟲肌肉收縮干擾觀察效果。

在本文中, 利用受精后的發育時長(hours post fertilization, hpf)來衡量胚胎及幼蟲的發育階段, 例如6 hpf即是指受精后6 h的胚胎樣品。本研究所選擇的發育時期主要包括卵裂期胚胎(3 hpf)、原腸胚(4—8 hpf)、擔輪幼蟲(9—13 hpf)以及面盤幼蟲(14—24 hpf)。需要說明的是, 笠貝的發育是一個連續、漸變的過程, 上述對不同發育階段的界定辦法是根據特征性結構大體劃定的, 并不絕對。目前在貝類發育領域對該問題尚無一個統一的標準, 其他學者可能有不同的觀點(如認為8 hpf的樣品為擔輪幼蟲)。前述界定標準可以將笠貝的發育與其他動物進行最大程度的類比, 因此本文選擇了這種方式。

1.2 掃描電子顯微鏡觀察

戊二醛固定的樣品經乙醇脫水后梯度轉移至乙酸異戊酯中, 經超臨界二氧化碳干燥后噴金, 于掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 原腸作用前的笠貝胚胎(4 hpf前)

同其他多數軟體動物一樣, 笠貝的卵裂模式是典型的螺旋卵裂。3.5 hpf左右, 胚胎發育至60—64細胞階段, 進入原腸作用的起始階段。在原腸作用發生之前, 胚胎形態是規則的球狀, 結構比較簡單。在此階段胚胎背腹軸尚未形成, 通過掃描電鏡觀察不到背側和腹側的區別, 早期受精時形成的極體尚能分辨(圖1a, 黃色箭頭)。該階段比較明顯的變化是纖毛細胞的發育(圖1)。3 hpf時已經可以觀察到胚胎表面的部分細胞有纖毛形成, 4個細胞為一組, 共4組, 這是將來形成前擔輪環(prototroch)的主要細胞群體。

圖1 原腸作用前的笠貝胚胎

注: a. 3 hpf; b. 4 hpf。黃色箭頭表示極體。比例尺為50 μm

2.2 原腸胚階段(4—8 hpf)

笠貝胚胎從3.5—4 hpf進入原腸作用階段, 8 hpf時原腸作用基本完成。在這一階段細胞分化和運動劇烈, 胚胎的形態發生了巨大的變化, 產生了一系列特征性結構。

(1) 前擔輪環逐漸形成

3 hpf時觀察到的四簇纖毛細胞逐漸變形并相互靠攏, 臨近的一些其他細胞也開始逐漸長出纖毛。5 hpf時, 纖毛細胞細胞已經較為規律圍繞胚胎形成一個圓環, 構成前擔輪環的雛形(圖2a), 在6 hpf時前擔輪環已經基本形成(圖2c, 2h)。

(2) 細胞劇烈運動

通過原腸作用, 胚胎形成外胚層在外部而中、內胚層細胞在內部的三個胚層。在笠貝中, 主要的中胚層細胞在原腸作用早期形成時即已經位于胚胎內部, 而內胚層則還暴露在外部。因此笠貝的原腸作用主要涉及內胚層細胞的內化, 這主要通過細胞運動完成。在這個時期, 外胚層和內胚層細胞可以根據細胞表面是否存在微絨毛狀結構區分開來(該結構僅存在于內胚層細胞中, 見圖2綠色陰影部分)。掃描電鏡觀察可見, 隨著原腸作用地進行, 內胚層細胞逐漸被外胚層細胞所包被, 呈現經典的外包過程。這種外包由背側外胚層細胞引發, 分別向左、右、后三個方向包裹內胚層細胞, 直至在腹側愈合(圖2g—2k)。內胚層細胞逐漸進入胚胎內部, 并將部分與其相連的外胚層細胞帶入, 最終在7—8 hpf時二者共同形成了胚孔(blastopore) (圖2j, 2k), 這是將來幼蟲口的雛形。從以上過程可以看出, 笠貝胚胎原腸作用中向腹側的細胞運動導致形成了腹側結構, 包括胚孔和腹板(ventral plate, 見下方描述)。另外需要指出的是, 盡管從外表上看起來笠貝原腸作用僅限于由背側向腹側的細胞運動(外包), 但有證據表明在靠近前擔輪環的區域存在一個反方向的、腹側向背側的外胚層細胞運動(Yang, 2020)。相應的, 向背側運動的細胞形成了胚胎的背側結構(貝殼發育區, 見下方描述)。

(3) 背腹側發育差異逐漸顯現, 典型的背腹側結構出現

除了明顯的細胞運動過程, 在原腸作用開始的前50%階段, 沒有明顯的組織和細胞分化。如上所述, 胚孔大約在7 hpf形成于腹側組織中。此時, 腹側的其他外胚層細胞呈現一種兩側對稱分布的模式, 即腹板(圖2j, 2k)。腹板細胞可以大致認為是神經外胚層, 是將來足原基的一部分(王倩等, 2019)。在背側, 多數外胚層細胞逐漸形成同心圓狀排列, 從7 hpf開始, 靠近前擔輪環的區域開始出現凹陷(圖2e), 開始形成貝殼形成區(shell field)。隨著內陷區域細胞的表面逐漸發育出絨毛狀結構, 至8 hpf時一個典型的貝殼形成區形成, 包括內陷的表面密布微絨毛的細胞, 以及外緣部分同心圓狀排列的細胞(圖2f)。

(4) 原腸作用過程存在一些外觀獨特的細胞

在觀察笠貝胚胎發育的過程中, 我們在某些時間點觀測到一些明顯與鄰近細胞形態不一致的細胞。5—6 hpf時, 靠近背側的底面有一呈圓形并且比較突出的細胞(圖2a, 2c, 2h, 紅色三角)。分析其位置發現該細胞似乎是內陷細胞群中最邊緣且最靠近背側的一個細胞, 出現在三角形內陷細胞群體的尖端(圖2a, 2h)。從5 hpf開始, 可以觀察到胚胎的底部有兩到三個表面有纖毛生長的細胞, 這是端纖毛細胞(圖2, 藍色三角)。

圖2 原腸胚階段的笠貝胚胎

注: 綠色陰影: 內胚層細胞; 白色虛線: 貝殼形成區; 藍色三角: 端纖毛細胞; 紅色三角: 一個發育過程中出現的特殊細胞, 形態與其他細胞存在差別; 黃色箭頭: 背側細胞運動方向。比例尺為50 μm

2.3 幼蟲發育過程(9—24 hpf)

笠貝幼蟲貝殼自9 hpf即形成, 同時腹側的胚孔也進一步縮小, 與之后幼蟲期的口沒有明顯差異。因此, 可以大體認為笠貝在9 hpf進入了擔輪幼蟲時期。擔輪幼蟲是軟體動物的重要發育階段, 具備特征性的結構, 主要包括背側的貝殼和腹側的足原基以及幼蟲口。但是我們沒有在身體末端觀察到肛門, 可能與笠貝幼蟲攝食現象不明顯相關。在這個階段, 前擔輪環部位的纖毛細胞變化不大。笠貝的擔輪幼蟲期很短, 僅數小時, 14 hpf左右貝殼已經包被了大部分幼蟲身體(圖3i), 進入早期面盤幼蟲階段, 至24 hpf時形成典型的面盤幼蟲(圖3j)。這兩個幼蟲階段盡管形態存在差別, 但是其發育過程是連續和漸變的, 因此下面整體介紹這個階段的幼蟲發育情況。

在背側, 貝殼形成區逐漸重新外翻并且面積迅速擴大(圖3a—3d)。9 hpf時的貝殼形成區還具有較深的凹陷, 凹陷內部的細胞表面有絨毛樣結構, 可能是偽足(lamellipodia), 凹陷區外圍的細胞呈規律的長條形緊密的分布(圖3a)。我們之前的研究表明, 此時幼蟲貝殼已經開始形成(Yang, 2020)。10 hpf時, 貝殼形成區進一步變大, 凹陷深度變淺, 凹陷區細胞表面偽足消失, 貝殼十分明顯, 周圍長條形的細胞變得扁平(圖3b)。11—12 hpf, 貝殼飛速擴張, 中央部位略微突起(圖3c, 3d)。到12 hpf時, 貝殼基本覆蓋整個背部(圖3d)。在之后的發育中, 貝殼繼續向后端和腹側生長, 逐漸包被整個幼蟲(圖3h—3j)。

在腹側, 胚孔逐漸收縮形成口, 口兩側的腹板部位逐漸形成兩團隆起且對稱的細胞(圖3e), 標志著足原基開始逐漸形成。在10—11 hpf時, 這些隆起的細胞團之間原本存在的凹陷消失, 這些細胞團融合成一個完整的組織, 構成足原基的雛形(圖3f, 3g)。在之后的發育中, 由于貝殼的包裹和入侵, 足原基逐漸埋入貝殼的生長緣下方。本來位于身體末端的端纖毛細胞隨著貝殼的推擠也向腹側移動, 并始終位于足原基后方, 其上的纖毛進一步變長變多, 形成1簇長纖毛(圖3f, 3h—3j)。在24 hpf, 這些纖毛細胞尚未被卷入胚胎內部, 而是形成了一個單獨的突起結構(圖3j)。這些細胞是否整合入了足原基的發育, 抑或者形成了別的結構, 尚待進一步研究。

3 討論

作為典型的等裂型發育的軟體動物, 笠貝的早期發育過程呈現幾個關鍵特點。首先, 前幾次卵裂為等裂, 其早期胚胎沒有明顯的不對稱性, 無法分辨背腹側。其次, 其原腸作用體現為內陷和外包合并進行的特點, 涉及大量的細胞運動過程。最后, 其發育過程中出現典型的擔輪幼蟲和面盤幼蟲階段, 既呈現出軟體動物乃至螺旋卵裂動物(Spiralia)的共同特點, 又有種系特異性特征。對這些發育過程的系統分析, 可為比較不同軟體動物的發育模式、深入探討軟體動物的發育機制提供基礎支持。

前擔輪環是擔輪幼蟲最有特色的結構。在前擔輪環形成過程中, 早期的纖毛細胞呈現四個細胞一組、共四組細胞同時出現、同步發育的特點。軟體動物早期的螺旋卵裂方式極其保守, 每個卵裂球均有標準命名, 可以用于追蹤細胞譜系并開展不同種類間的比較。卵裂球的命名規則主要包括具體的譜系(A、B、C、D)、是否是大卵裂球(大寫或小寫字母)、來自第幾次卵裂(前綴及上標)等。例如1a1細胞即指第四次卵裂時, 位于動物極的1a細胞分裂后形成的偏向動物極一側的子細胞。在某些情況下需要描述地位相當的全部四個譜系的細胞, 此時用q/Q來指代(quartet的縮寫)。例如, 1q1即是1a1—1d1四個細胞的統稱。貝類早期胚胎纖毛細胞的起源比較清楚, 細胞譜系分析表明它們來自于第四次卵裂形成的1q2細胞(Dictus, 1997)。這種發育模式十分普遍, 此前我們在牡蠣胚胎中也發現了這種現象(Tan, 2017)。事實上, 1q2細胞發育成前擔輪環, 并進一步將胚胎分為前后兩個部分, 是包括軟體動物在內的螺旋卵裂動物發育的一個共有模式(Nielsen, 2004, 2005)。因此, 前擔輪環的發育可能是螺旋卵裂動物演化過程中十分重要的一環, 也是歷來發育與演化生物學研究所關注和強調的重點(Nielsen, 2018)。在最近的一項研究中, 研究人員篩選了只在螺旋卵裂動物存在的特異性基因, 發現一部分這類基因僅表達于前擔輪環部位(Wu, 2020)。這些結果再次強調了前擔輪環在螺旋卵裂動物中的重要地位。前擔輪環的發育機制研究將繼續是螺旋卵裂動物發育與演化研究的關鍵科學問題。

圖3 笠貝幼蟲發育過程

注: a—g為擔輪幼蟲階段, h—j為面盤幼蟲階段。虛線表示幼蟲貝殼, 藍色三角表示端纖毛細胞。比例尺為50 μm

原腸作用及背腹軸的建立是本研究的重點問題。在包括笠貝在內的多種軟體動物中, 背腹軸的形成及原腸作用深度整合(Lyons, 2014), 我們的掃描電鏡觀察結果再次證實了這個觀點。例如, 從4 hpf至8 hpf能夠觀察到多個細胞由背側逐漸遷移到腹側的過程(圖2)。因此從某種意義上說, 對原腸作用的研究是解析笠貝背腹軸形成機制的關鍵問題。事實上, 軟體動物原腸作用方式與早期卵裂方式、背腹軸形成機制似乎已經完全聯系在一起。例如, 履螺()的早期卵裂中雖然存在極葉, 但其極葉極小(Henry, 2008)。雖然嚴格意義上其早期分裂應該屬于不等分裂, 但四個卵裂球差異不明顯, 與等裂型胚胎極為相似。相應地, 履螺的原腸作用也主要是外包, 背腹軸向的差異也是在這個過程中逐漸發育出來(Lyons, 2015)。這些結果提示, 存在一些遺傳上的限制, 使軟體動物的等裂型胚胎(以及近似等裂的胚胎)不約而同地選擇外包式的原腸化過程, 并采取相應的背腹軸形成機制。這與其他動物存在顯著區別。例如半索動物或者棘皮動物中, 等裂型胚胎的原腸作用多僅限于內陷而無明顯的外包過程(Lowe, 2006; Lapraz, 2009)。這一方面體現了不同類群動物在發育模式上的不同選擇, 另一方面也反映了其祖先傳遞給它們基因“工具箱”(gene toolkit)存在差異(Erwin, 2009)。這些動物為分析不同發育過程的遺傳限制提供了絕佳的研究對象。深入解析軟體動物卵裂模式—原腸作用—背腹軸形成三者緊密聯系背后的遺傳機制, 可能是理解軟體動物發育的重要方面。

笠貝背腹軸形成除上述提到的外包這一主要內容外, 我們還通過掃描電鏡觀察到了一些之前研究中尚未描述的典型細胞, 例如位于內陷細胞群最邊緣的突起細胞(圖2a)。目前, 該細胞的本質及其發育功能尚不能確定, 但獨特的形態特征提示它可能有較為特殊的功能和地位。對于發育生物學研究而言, 這類細胞可以作為特定的路標指示物, 輔助分辨胚胎期的結構, 其發育狀態和空間定位也可以作為發育分期的依據。目前對于軟體動物早期發育基因的研究十分活躍, 在后續的研究中有望鑒定這類細胞特有的標記基因, 進而解析其發育功能。

擔輪幼蟲形成后的發育過程中, 笠貝幼蟲既體現出軟體動物的共有特點, 也存在其種系特異性的發育過程。其中, 軟體動物幼蟲的共有特征包括背部的貝殼和腹部的足(圖3)。從掃描電鏡結果可以看出, 幼蟲貝殼形成后經歷了一個快速的生長過程, 并在幾小時內包裹整個幼蟲。與之相反, 足的發育則十分緩慢, 在我們的研究窗口中一直局限在一個原基的狀態。在前面的研究中我們解析了足原基的早期形成過程(王倩等, 2019), 在此不再贅述。笠貝種系特異性的發育特點主要體現在貝殼和面盤上。首先, 笠貝幼蟲貝殼的生長方向為背部—后方—腹部, 這是腹足綱動物的一個典型特點。而與此相對的是, 雙殼類及掘足類(角貝)的幼蟲貝殼則由背部向左右兩側生長(Wanninger, 2001; Huan, 2013), 這體現出不同類群軟體動物貝殼生長模式的顯著差別。其次, 笠貝幼蟲的面盤并不顯著擴張, 這與其他腹足綱動物顯著不同。在其他貝類(如脈紅螺及許多雙殼貝類等)中, 前擔輪環在面盤幼蟲期極度擴張, 形成兩片巨大的葉狀結構, 輔助幼蟲游泳。目前, 對于這種面盤發育模式的差異還沒有一個統一的解釋, 可能與它們的生存策略有關。這些差異是理解不同軟體動物發育機制和適應策略的重要方面。

4 結論

本研究中利用掃描電鏡觀察了典型海洋軟體動物笠貝的早期發育過程。研究結果發現笠貝胚胎在前擔輪環形成、原腸作用等方面體現出與諸多螺旋卵裂動物相似的保守特征, 同時還描述了笠貝胚胎在貝殼生長方式及面盤發育上的獨特特點。這些結果為理解軟體動物的發育機制, 探討不同軟體動物類群的演化機制提供了基礎支持。

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EARLY DEVELOPMENT OFREVEALED BY SCANNING ELECTRON MICROSCOPY

CUI Meng-Lu1, 2, HUAN Pin1, LIU Bao-Zhong1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Researches on the early development of mollusks are essential to understand the mechanisms of molluscan development and evolution. We investigated the early development of the limpetusing scanning electron microscopy (SEM). Results of SEM revealed quick development of this species: the trochophore larva formed at around 9 hpf and typical veliger larva emerged at 24 hpf. The development ofmainly included the characteristic epibolic gastrulation and the development of various structures such as prototroch, shell field, and foot anlagen. In general, the early development ofexhibited characters of an equal cleaver (e.g., the epibolic gastrulation) and also species-specific characteristics of the gastropod lineage (e.g., the larval shell growth toward the ventral side through the posterior pole). The findings provide a basic support for in-depth study of the molecular mechanisms of early development of.

; gastrulation; shell; foot; prototroch

* 國家自然科學基金項目, 41776157號。崔夢露, 碩士研究生, E-mail: cui_menglu@163.com

郇 聘, 博士生導師, 研究員, E-mail: huanpin@qdio.ac.cn

2021-03-15,

2021-05-06

Q344

10.11693/hyhz20210300068