曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)促性腺激素釋放激素(GnRH)基因的鑒定、特征及成熟期的表達研究*

吳俊虹 曹子豪 鄭利兵 遲長鳳

曼氏無針烏賊()促性腺激素釋放激素(GnRH)基因的鑒定、特征及成熟期的表達研究*

吳俊虹 曹子豪 鄭利兵 遲長鳳①

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院 國家海洋設施養殖工程技術研究中心 海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合實驗室 舟山 316022)

促性腺激素釋放激素(GnRH)在脊椎動物的繁殖過程中起著至關重要的作用, 同時也存在于許多無脊椎動物中。利用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆出曼氏無針烏賊()促性腺激素釋放激素(命名為, KP 982885.1)。基因的cDNA全長710 bp, 開放閱讀框(ORF)為273 bp, 編碼90個氨基酸, 包括一條含有31個氨基酸的信號肽、12個氨基酸的GnRH多肽和44個氨基酸的GnRH相關肽(GAP)；與劍尖槍烏賊()和真蛸()的同源性分別為86.7%和73.3%；GnRH高度保守的十二肽與劍尖槍烏賊和真蛸的GnRH相似度達100%, 其信號肽的相似性分別為66.7%和54.8%, GAP區的相似性分別為95.5%和77.3%；實時熒光定量PCR (qRT-PCR)結果顯示,基因在成熟期的表達具有特異性, 在腦中表達量最高, 且與其他組織差異顯著(0.05)；采用原位雜交技術檢測mRNA在腦內的表達模式, 結果表明:在食道上神經團、食道下神經團和視葉的不同部位均有表達, 暗示可能參與曼氏無針烏賊的生殖調控作用。

曼氏無針烏賊()；神經肽；促性腺激素釋放激素(GnRH)；生殖調控

促性腺激素釋放激素(GnRH)主要由下丘腦神經元-合成和分泌, 調節下丘腦-垂體-性腺軸, 參與控制許多脊椎動物和無脊椎動物的生殖過程(Gottsch, 2004; Chaiyamoon, 2020)。無脊椎動物的GnRH與脊椎動物的GnRH在結構和功能上同源, 參與調節生殖相關功能, 包括卵巢成熟和產卵(Tinikul, 2014; Chaiyamoon, 2020)。脊椎動物的GnRH可刺激促性腺激素的產生和分泌(Ma, 2020), 且對性別分化的開始和整個生殖過程都至關重要(Counis, 2005)。脊椎動物中的GnRH主要分為三種類型: GnRH-I、GnRH-II和GnRH-III, 且在同一個物種中GnRH可有多種形式(Chang, 2018)。GnRH-I存在于鳥類、兩棲動物和魚類中, 包括哺乳動物形式(GnRH)和各種魚類特有的形式, 如GnRH、GnRH、GnRH、GnRH和GnRH。GnRH-I存在于視前區(POA)和下丘腦的神經元中(Selvaraj, 2012)；GnRH-II存在于所有脊椎動物中, 主要表達部位集中在中腦區域(Schneider, 2008)；GnRH-III僅存在于硬骨魚中, 集中表達在嗅球、末梢神經節和POA的神經元中(Kah, 2007)。在七鰓鰻中的GnRH-I和GnRH-III一開始被分為GnRH-IV型(Nozaki, 2000; Silver, 2004), 但后來分析證明, 其與GnRH-II和GnRH-III有共同的祖先, 因此不再被歸類為GnRH-IV型(Decatur, 2013)；GnRH-V目前僅包含軟體動物的兩種類型, 分別為真蛸()分離出的GnRH, 以及海蝸牛()分離出的GnRH (Zhang, 2008), 其主要表達在中樞神經系統與外周神經系統中(陳蕾等, 2003), oGnRH還可刺激真蛸的卵巢和精巢產生睪酮、孕酮和雌二醇(Kanda, 2006)。有趣的是, 所有脊椎動物的GnRH亞型都是十肽(Zhou, 2012), 而GnRH是十二肽,GnRH是十一肽(Tsai, 2010)。GnRH除參與軟體動物生殖外, 還影響其基本生理活動, 如心率、脂肪代謝和行為等(Tsai, 2018)。

曼氏無針烏賊()曾是東海具有較高經濟價值的四大海產之一。自20世紀70年代以來, 由于過度捕撈和環境變化, 資源逐漸衰減, 因此, 發展人工養殖具有重要意義。然而, 在人工養殖過程中, 人們發現該物種出現性早熟現象(Cao, 2016)。因此, 本研究首次克隆曼氏無針烏賊基因的全長, 并分析該基因在不同組織中表達的特異性和在腦中的表達位置, 旨在為曼氏無針烏賊的人工繁育提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

成熟時期曼氏無針烏賊采自浙江舟山東極島曼氏無針烏賊養殖基地, 體重為80—120 g。烏賊飼養溫度23—25 °C, 鹽度28—30, 光照周期為光照14 h, 黑暗10 h, 定時投喂蝦, 2次/d。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

用0.1%乙醇將烏賊麻醉5—10 min, 解剖取腦、鰓、心臟、肌肉、肝臟、卵巢、纏卵腺、副纏卵腺和精巢組織, 放至液氮速凍, –80 °C保存備用。采用Trizol法提取組織總RNA (TaKaRa), 采用PowerScript逆轉錄酶(TaKaRa)合成第一鏈cDNA, 42 °C反應90 min后使用NucleoSpin柱(TaKaRa)進行純化。

1.3 SjGnRH基因全長克隆

根據真蛸(BAB 86782.1)和劍尖槍烏賊(, BAH 09303.1)序列設計兼并引物-F/-R (表1), 擴增反應按照本實驗室的前期工作進行, 并稍做改動(Cao, 2016)。根據引物-F/-R擴增出來的核心序列設計用于cDNA末端快速擴增(RACE)的特異性引物, 5′-RACE和3'-RACE操作均根據Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)的說明書進行, 然后將PCR產物克隆到pUCm-T載體(Bio Basic), 并送至生工生物工程(上海)公司進行測序。

表1基因克隆引物信息

1.4 SjGnRH基因生物信息學分析

以Premier 5.0設計核心片段擴增引物和RACE引物；NCBI ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框(ORF)；運用軟件DNAMAN 8.0將基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列, 并用Laser gene軟件(DNAStar, Inc., Madison, Wisconsin, USA)分析cDNA序列。使用生物序列分析中心 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP)的SignalP 4.1鑒定潛在的信號肽及信號肽切割位點；通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測其蛋白結構域；多序列比對分析通過ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)完成；ExPASy ProtParam Server (http://web.expasy.org/protparam/)用來預測蛋白的理化性質如蛋白分子量(MW)及等電點(pI)；Phylogeny.fr Gblocks 0.91b Server (http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/one_task.cgi?task_type =gblocks)提取待建樹氨基酸序列的保守區間。利用軟件MEGA-X根據推導的氨基酸序列進行最大似然法進化樹的構建。

1.5 qRT-PCR檢測SjGnRH基因表達

qRT-PCR使用SYBR PreMix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa), 按照7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)的說明書進行, 反應體系和反應條件參考本實驗室先前的工作積累進行(Cao, 2016), 選用曼氏無針烏賊(JN564496.1)作為內參基因。

1.6 原位雜交檢測SjGnRH基因mRNA在腦中的表達

原位雜交插入片段為基因cDNA中位于第49—305位的核苷酸, 將其克隆至pSPT 18質粒, 再以R I和d III將質粒線性化, 用SP6/T7 Dig RNA標記試劑盒(Roche Diagnostics)引入地高辛標記正、反義RNA探針, 樣品處理和操作流程按照我們實驗室先前的工作稍有改動(Cao, 2016)。

1.7 數據分析

用2–ΔΔCt法分析在mRNA水平的表達, 所有數據均與心臟的mRNA表達水平進行對比, 結果以平均值±標準差(S.D.) (=3), 數據分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 然后進行檢驗, 顯著性由0.05表示。

2 實驗結果

2.1 SjGnRH基因的鑒定及特性分析

基因(KP 982885.1)的cDNA全長為710 bp, 包含273 bp的ORF、86 bp的5′-非編碼區(UTR)以及352 bp的3′-UTR(圖1)；GnRHMW為10.1 kDa, 預測pI為7.71；BLASTn分析結果表明,與劍尖槍烏賊和真蛸的序列具有較高的相似性；預測的GnRH蛋白序列包括31個氨基酸的信號肽、高度保守的十二肽和44個氨基酸的GnRH相關肽(GAP)；在十二肽的C末端之后存在一個切割位點(GKR, Gly-Lys-Arg), 這表明酰胺化發生在翻譯后的加工過程中。

圖1 SjGnRH基因的序列分析

注: 預測的N-末端信號肽用黑色下劃線表示。預測的跨膜區域用灰色陰影表示, 預測的磷酸化位點用紅色線框標記。預測的起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TGA)和多聚腺苷酸信號(AATAAA)用黑色線框標記。序列中所含的GnRH的十二肽以紅色字體標出, 堿性切割位點以綠色字體標出, C末端酰胺化甘氨酸以藍色字體標出。GnRH相關肽(GAP)以虛線標出

2.2 SjGnRH基因的同源性和系統發育分析

將預測的氨基酸序列與不同物種的GnRH氨基酸序列在ClustaW2網站上進行了比對(圖2), 所用序列的GenBank登錄號分別如下: 曼氏無針烏賊(KP 982885.1)、真蛸(BAB 86782.1)、劍尖槍烏賊(BAH 09303.1)、皺紋盤鮑(, ARE 30281)、澳大利亞綠邊鮑(, AKR 13997.1)、美洲牡蠣(, XP 022319572.1)、長牡蠣(, ADZ 17180.1)、蝦夷扇貝(, XP 021347551.1)和法螺(, AQS 80512.1)。對比結果表明, 預測的與劍尖槍烏賊和真蛸中的相似度分別為86.7%和73.3%；Sj高度保守的十二肽與劍尖槍烏賊和真蛸的oct有100%的相似性，其中，信號肽區的相似性分別為66.7%和54.8%，GAP區的相似性分別為95.5%和77.3%。

圖2 曼氏無針烏賊與其他物種的GnRH氨基酸序列比對

注: 序列中相同的氨基酸用黑色表示, 保守序列標記為灰色

軟體動物GnRH的氨基酸序列如圖3所示。頭足類物種之間有高度保守的序列和結構上的相似性。到目前為止, 已在三種雙殼綱海洋貝類長牡蠣(Bigot, 2012)、蝦夷扇貝(Nagasawa, 2015b)和菲律賓蛤仔() (Song, 2015)中發現了GnRH, 這些研究表明, 神經節內存在以下兩種形式的GnRH肽:GnRH 12 aa-OH和GnRH 11 aa-NH2。

為確定GnRH的進化位置, 利用脊椎動物和無脊椎動物的GnRH前體蛋白序列, 以最大似然法構建了系統發育樹(圖4)。分析結果表明,GnRH與無脊椎動物GnRH聚在一起, 且與擬目烏賊()、虎斑烏賊() GnRH的親緣關系較近。

圖3 不同種類GnRH與氨基酸序列對比圖(驗證或推導)

注: 黃色表示在大多數動物中高度保守的氨基酸, 灰色表示更為保守的氨基酸

圖4 SjGnRH的氨基酸序列與其他物種的GnRH氨基酸序列通過最大似然法構建系統進化樹

2.3 SjGnRH在不同性別曼氏無針烏賊組織中的表達分布

在曼氏無針烏賊不同性別組織中的表達模式如圖5所示。實驗結果表明,在不同性別的組織中均有表達, 但表達水平不同；其中, 在雌性和雄性的腦中表達量較高, 與其他組織表達水平呈顯著性差異(0.05)。

2.4 SjGnRH基因mRNA在腦組織中的定位

如圖6所示,mRNA陽性信號廣泛存在于大腦中, 當與正義探針(陰性對照)雜交時, 沒有檢測到明顯的信號(圖6a)；烏賊的大腦由三個主要部分組成: 食道上神經團、食道下神經團和視葉(于新秀等, 2011)；特異性表達存在于食道上神經團的多個區域, 且主要在胞體表達, 表達最強的是腦亞腳葉和亞垂直葉(圖6b), 其次是下額葉(圖6c)和后基底葉(圖6d), 而最弱的表達出現在前基底葉；在食道下神經團(圖6e), 三個形態不同的區域(前、中、后區)均有陽性表達。其中, 在食道下神經團前部, 腕葉呈陽性染色；在食道下神經團中部, 足葉呈陽性染色；在食道下神經團后部,主要表達在巨細胞葉和外套內臟葉；探針在視葉的髓質中(圖6f)也出現陽性信號, 而在視腺或嗅葉中未見陽性表達。

圖5 SjGnRH基因mRNA在不同曼氏無針烏賊組織中的分布

注: 以心臟表達水平作為參考值。結果以平均±標準差(S.D.)(=3)表示, 分別分析在雌性與雄性不同組織中的表達含量, 包括腦、鰓、心臟、肌肉、肝臟、卵巢、纏卵腺、副纏卵腺和精巢。以作為內參基因, 對組織表達量進行LSD(Least significant Difference)多重比較, 圖中的a、b和c代表組織表達量之間存在顯著性差異(<0.05)

圖6 SjGnRH基因mRNA在腦組織的原位雜交

注: a.正義探針對照圖; 反義探針組: b. 亞垂直葉; c. 下額葉; d. 后基底葉; e. 食道下神經團; f. 視葉。陽性信號以黑色箭頭標出。VL. 垂直葉; SVL. 亞垂直葉; SPL. 腦亞腳葉; SFL. 上額葉; IFL. 下額葉; ABL. 前基底葉; PBL. 后基底葉; BL. 腕葉; PL. 足葉; PVL. 外套內臟葉; MAG. 巨細胞葉

3 討論

3.1 SjGnRH基因的鑒定及分析

的cDNA全長為710 bp, 包含273 bp的開放閱讀框(ORF), 編碼90個氨基酸, 其信號肽由31個氨基酸組成, 具有高度保守的十二肽, GAP序列為44個氨基酸；在十二肽的C末端之后存在一個切割位點(GKR, Gly-Lys-Arg), 這與脊椎動物相似, 表明酰胺化發生在翻譯后的加工過程中, 無脊椎動物促性腺激素釋放激素活性的C末端結構可能是保守的(Onitsuka, 2009)。

根據預測的GnRH氨基酸序列與其他物種多序列比對的結果, 我們認為GnRH在成熟肽區高度保守, 但在N端信號肽和C端GAP區表現出變異；ClustalW分析表明,GnRH的氨基酸序列與劍尖槍烏賊和真蛸中的GnRH分別有86.7%和73.3%的相似性, 信號肽區的相似性分別為66.7%和54.8%, GAP區的相似性分別為95.5%和77.3%；且GnRH高度保守的十二肽與劍尖槍烏賊和真蛸的GnRH有100%的相似性；進化樹結果顯示:GnRH與真蛸和劍尖槍烏賊的GnRH聚于一類, 與海兔()、網紋野蛞蝓()等腹足綱的親緣關系較遠, 其中與真蛸GnRH的親緣關系比劍尖槍烏賊GnRH的更近。這表明在曼氏無針烏賊中克隆的屬于僅存在于軟體動物中的GnRH-V類型, 且屬于其中的。對槍烏賊()腦內的GnRH神經元進行免疫組織化學分析, 觀察到兩種類型的GnRH神經元, 表明在槍烏賊腦中至少存在兩種類型的GnRH神經系統(Amano, 2008)；在雙殼動物中發現了兩種GnRH多肽, 即十一肽和十二肽, 如長牡蠣(Bigot, 2012; In, 2016)、蝦夷扇貝(Nagasawa, 2015a, b), 這些數據進一步表明, 在無脊椎動物同一物種中可能存在不同形式的GnRH, 在曼氏無針烏賊中是否存在多種形式的GnRH還需進一步證明。

3.2 SjGnRH在不同性別組織中的表達分布與組織定位

qRT-PCR結果表明,在曼氏無針烏賊的雌性腦、卵巢和雄性腦中均表達顯著, 這一結果與其他頭足類動物相似。對商烏賊()的RT-PCR分析結果表明GnRH在腦、卵巢和卵中都有表達(Di Cristo, 2009)；在劍尖槍烏賊中, RT-PCR和Southern blot分析結果表明,基因的前體主要在中樞神經系統表達(Onitsuka, 2009)；在海蝸牛中,GnRH-like肽(Tsai, 2010)存在于中樞神經和外周組織；長蛸()的qRT-PCR研究結果中顯示,GnRH主要表達于神經系統及神經纖維所控制的部分組織, 在雌雄個體的食道上、下神經團中表達量都較高, 在雄性的精巢中表達次之, 而在雌性的卵巢中表達則較低(朱之發等, 2020), 本文實驗結果顯示在雌、雄腦中的表達量最高, 在卵巢中的表達較高, 精巢的表達則較低, 推測的表達量可能與性腺發育時期相關。

有研究顯示: GnRH-I與GnRH-II的類似物能夠促進大西洋鱈魚()的排卵(Hildahl, 2011)；GnRH和GnRH在大菱鲆中的表達量具有周期性變化(趙春彥, 2017), 這兩種類型的GnRH在進化上趨同(Imanaga, 2014; Andrea, 2016),GnRH可輔助GnRH表達；GnRH在性腺與腦中的表達模式相似, 可能具有一定的關聯性(趙春彥, 2017), 另外,GnRH在性腺中的高表達表明了GnRH系統同時具有刺激性腺成熟和調控性腺發育作用(趙春彥, 2017), 同時說明GnRH與繁殖作用聯系緊密, 還能促進生殖腺的生長發育和精卵細胞的產生(Gray, 2002)；且GnRH在條斑星鰈的卵巢發育與排出過程中也具有重要作用(Masafumi, 2008)；GnRH類似物對LH的釋放以及產卵作用也具有促進作用(Nyuji, 2013)；有研究發現GnRH多肽在金頭鯛()和鯖魚(Gothilf, 1997; Selvaraj, 2012)中, 也有參與生殖調控的功能。GnRH在性腺的高表達表明了GnRH系統在刺激性腺成熟、調控性腺發育(Powell, 1996)和調節雌雄性腺激素含量的作用(Soverchia, 2007)。在軟體動物中的研究顯示, 如真蛸GnRH肽的轉錄本在食道上神經團、食道下神經團、視腺以及腦腳葉中均有表達(Iwakoshi, 2002)；先前的一項研究提供了有關表達基因mRNA的神經元胞體在中樞神經系統的定位, 以及在真蛸中樞和外周器官中的GnRH免疫反應胞體和纖維分布的詳細信息(Iwakoshi-Ukena, 2004), 在該研究中,的mRNA表達定位在食道上神經團的前后背側基底葉、下額葉以及后頰葉, 與食道下神經團的外套內臟葉、足葉、后腕葉、前臂葉、血管舒縮葉以及視葉中；在本研究中,基因mRNA在食道上神經團的腦亞腳葉、亞垂直葉、前基底葉、后基底葉和下額葉均出現不同程度的陽性表達, 在食道下神經團的巨細胞葉、外套內臟葉、足葉和腕葉以及視葉也有陽性表達, 這與先前的結果研究結果基本一致。在真蛸的中樞和外周器官中GnRH樣免疫反應胞體和纖維的分布表明,GnRH參與了腦亞腳葉-視腺軸, 這與脊椎動物的下丘腦-垂體軸相似, 都有參與生殖的功能(Di Cosmo, 1998; Iwakoshi, 2002; Iwakoshi-Ukena, 2004)。GnRH除了促進生殖作用之外, 還參與很多其他重要的生理作用, 包括進食(Newth, 1972)、觸覺和記憶(Balaban, 1996)、運動和自主行為(Iwakoshi-Ukena, 2004)等。此外, 在槍烏賊腦組織中分別進行了GnRH-II和GnRH類似物抗體的免疫組織化學, 顯示GnRH-II免疫陽性的胞體主要存在于巨細胞葉和視葉(Amano, 2008), 陽性神經纖維廣泛分布于腦組織(Osada, 2013)。GnRH類似物免疫陽性的細胞體廣泛分布于巨細胞葉中, 但在嗅葉和垂直葉中分布較少。束狀軸突從腹部巨細胞葉延伸到腦內部, 免疫陽性神經纖維主要分布在食道上神經團與食道下神經團中, 但視葉中只有神經纖維有免疫陽性反應(Amano, 2008)；在真蛸的腦亞腳葉、嗅葉和視葉中均發現GnRH神經肽, 在視腺細胞上也發現含有GnRH神經肽的神經末梢, 而視腺分泌活動受神經肽的調控, 因此, 推測嗅葉可能是GnRH神經肽的來源(Di Cosmo, 1998; Iwakoshi-Ukena, 2004)；而本研究結果表明,探針在視葉的髓質中出現陽性信號, 但在視腺或嗅葉卻未見陽性表達。對GnRH的免疫反應也出現在其他物種的大腦中, 如淡水硬骨魚高身麗脂鯉()的嗅球、末梢神經節、視前區、中腦被蓋核, 也存在于縱環核、腎小球核以及丘腦背側中央和背側后核(Gomes, 2013)。我們推測, 這幾項研究結果之間的差異可能是由于物種差異性所致, 也可能是由于不同物種的在生殖周期內受到周圍環境刺激的影響所致, 如光周期、溫度等(Andrea, 2016)。在本研究中, 針對我國重要的經濟烏賊——曼氏無針烏賊, 進行了基因的克隆鑒定以及系統發育特征分析, 這將有助于我們理解GnRH在無脊椎動物中的適應和進化過程, 關于在曼氏無針烏賊中的生理調控機制還有待進一步研究。

4 結論

(1) 在曼氏無針烏賊中克隆的基因屬于僅存在于軟體動物中的GnRH-V類型, 且屬于其中的。

(2)具有高度保守的十二肽, 與真蛸GnRH的親緣關系比劍尖槍烏賊GnRH的更近。

(3)在雌、雄無針烏賊腦中的表達量顯著高于其他組織。

(4)在食道上神經團的腦亞腳葉和亞垂直葉表達最強, 其次是下額葉、后基底葉以及前基底葉；在食道下神經團的腕葉、足葉、巨細胞葉和外套內臟葉中均有陽性表達；在視葉的髓質中也出現陽性信號, 而在視腺或嗅葉未見陽性表達。

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IDENTIFICATION, CHARACTERIZATION, AND EXPRESSION ANALYSIS OF A GNRH-LIKE GENE AT MATURE STAGE IN THE CEPHALOPOD(SEPIIDAE)

WU Jun-Hong, CAO Zi-Hao, ZHENG Li-Bing, CHI Chang-Feng

(National and Provincial Joint Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Aquatic Genetic Resources, National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, School of Marine Science and Technology, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is known for playing a crucial role in vertebrate reproduction and has been characterized in many invertebrate species. In this study, a-like gene (designated, KP 982885.1) was firstly identified in the common Chinese cuttlefishusing rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The full-length sequence ofcDNA is 710 bp and the open reading frame (ORF) contains 273 bp, encoding 90 amino acids, a putative signal peptide containing 31 amino acids, a 12 amino acid GnRH peptide and a 44 amino acid GnRH related peptide (GAP) sequence. It has 86.7% and 73.3% identity withand, respectively. The highly conserved dodecapeptide ofshares 100% similarity withGnRH ofand, exhibits 66.7% and 54.8% similarity in the signal peptide region, and 95.5% and 77.3% in the GAP region, respectively. According to the results of qRT-PCR, thegene is tissue-specific at the mature stage, with the highest expression in brain, which is significantly different from other tissues (<0.05). The expression pattern ofmRNA was detected in the brain usinghybridization method. Therefore,is expressed in different regions of the supraoesophageal mass, subesophageal mass, and optic lobes, which suggests thatmight be involved in the reproduction of the cuttlefish.

; neuropeptide; GnRH; reproduction

* 國家自然科學基金項目, 31872547號; 浙江省自然科學基金項目, LY20C190007號。吳俊虹, 碩士研究生, E-mail: wu2964061429@hotmail.com

遲長鳳, 博士, 教授, E-mail: chicf@zjou.edu.cn

2021-04-07,

2021-05-14

Q789; S931; S968

10.11693/hyhz20210400083