不同年齡段女性液基薄層細胞學、高危型人乳頭瘤病毒分型檢測及DNA倍體分析在宮頸癌篩查中的作用

楊耀湘，梁顏笑，王小拍

廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學附屬第二醫(yī)院)病理科，廣東廣州510180

宮頸癌是女性常見、多發(fā)的一種生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來，我國宮頸癌的發(fā)病率不斷上升，是常見的婦科惡性腫瘤[1]，而且發(fā)病人群呈現越來越年輕的趨勢[2]。防治宮頸癌的關鍵在于定期進行婦科檢查及宮頸癌篩查。宮頸癌篩查現在主要是用液基薄層細胞學（thinprep cytology test,TCT）技術檢測，TCT技術的廣泛應用使得宮頸病變的檢出率提高，但TCT檢測宮頸病變的特異性低，易導致漏診，并且假陽性較高[3]。人乳頭瘤病毒（HPV）有組織和宿主特異性，它只能感染人的粘膜上皮細胞和皮膚組織，人又是HPV的唯一宿主[4]。研究表明，宮頸癌的發(fā)生99%與HPV的感染有關，但在臨床上只檢測HPV的特異性比較低，而且HPV陽性并不一定會有宮頸的病變，臨床上對HPV陽性存在過度治療[5-6]。DNA是一種遺傳物質，它的結構和功能的改變是細胞惡變的分子基礎，而異倍體細胞的出現，是細胞癌變的特征性的指標[7-9]。因此可以通過檢測檢測細胞中DNA的含量，在其形態(tài)學改變之前檢測出癌變的細胞或有惡變傾向的細胞而實現癌前病變的早期診斷。該文對廣州市第一人民醫(yī)院2019年1月—2020年10月送檢的液基細胞學標本788例進行回顧性分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析廣州市第一人民醫(yī)院的液基細胞學送檢標本788份。選取的標本每一份均同時行TCT、HPV和DNA倍體分析聯合篩查。每份標本各對應1例患者，年齡19～78歲，平均（40.52±11.32）歲。將所有的標本按照患者年齡和檢測結果陰性、陽性進行分組。

1.2 方法

1.2.1 液基細胞學 所有受試檢者統(tǒng)一由有經驗的婦科醫(yī)師采取標本。于經期結束3～10 d以窺陰器暴露子宮頸后擦凈子宮頸口分泌物，采用TCT專用刷在宮頸口順時針旋轉3圈，停留10 s取材，標本放入TCT專用保存管保存行TCT常規(guī)檢測。標本震蕩混勻后，放入標本轉移機中取細胞懸液離心后制成薄層細胞學片，在放入自動染色機中行巴氏染色。宮頸細胞學診斷采用新TBS分類標準（2001年國際癌癥協(xié)會推薦）[10]，即：①正常范圍（WNL），包括未見上皮內病變和炎癥；②意義不明的不典型鱗狀細胞和腺細胞（ASCUS和AGUS）；③不除外高度鱗狀上皮內病變的不典型鱗狀細胞（ASCH）；④低度鱗狀上皮內病變（LSIL，包含HPV感染）；⑤高度鱗狀上皮內病變（HSIL）；⑥鱗癌（SCC）和腺癌（CA）。該文所指的TCT陽性指TCT檢查結果至少是意義不明的不典型鱗狀細胞和腺細胞（ASCUS和AGUS）以上，②～⑥為陽性診斷，檢查分級結果按照不同年齡層依次為≤30歲組、31～55歲組、＞55歲組。

1.2.2 DNA倍體分析 使用TCT標本瓶中的剩余標本，制成一張細胞薄層涂片，DNA倍體分析采用Feuigen染色，D用DNA Index（DI）表示DNA倍體，采用全自動圖像分析儀（automatic imaging cytometey,AICM）進行分析，并用標準的細胞片做對照，要求變異系數（coeficientof va riantion,CV）＜5%。每張圖片設定掃描8 000個細胞。對每張片上所有細胞核進行掃描測定，出現≥3個細胞、DI＞2.5的異倍體細胞、或1～2個細胞DI＞2.5的異倍體細胞為陽性，未見DNA倍體異常細胞則為陰性[11]。

1.2.3 HPV檢測 使用TCT標本瓶中的剩余標本，取1 mL細胞懸液，離心后棄去上清加生理鹽水震蕩混勻后離心，棄去上清加DNA提取液100℃孵育10 min后離心，取上清加入DNA提取管中擴增DNA后再顯色。采用安必平28型人乳頭狀病毒（HPV）基因分型檢測（PCR-反向點雜交法），其中高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82(MM4)；中危型26、53、66和低危型6、11、40、42、43、44、54、61、81（cp8304）、83（MM7）。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理數據，計數資料采用頻數或率（%）表示，配對計數資料比較運用配對χ2檢驗和Kappa一致性檢驗，Kappa≥0.4表示兩者一致性尚可，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3個年齡段3種檢測方法診斷結果比較

2.1.1 3個年齡段TCT檢查結果比較3個年齡段TCT異常結果差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.682，P=0.711）。見表1。

2.1.2 3個年齡段DNA倍體分析結果比較3個年齡段的DNA陽性率不相等差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7.388，P=0.022）。31～55歲組的DNA陽性率高于≤30歲組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝6.701，P=0.01）；≤30歲組與＞55歲組DNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝1.405，P=0.236）；31～55歲組與＞55歲組DNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.503，P=0.478）。見表1。

2.1.3 3個年齡段HPV檢測結果比較3個年齡段HPV陽性率對比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝2.960,P=0.228）。見表1。

表1 3個年齡段3種檢測方法診斷結果比較[n（%）]

2.2 液基細胞學檢測、高危型人乳頭瘤病毒檢測、DNA倍體分析結果

788例患者中，TCT檢測結果正常720例，異常68例；HPV檢測結果陰性622例，陽性166例；DNA倍體分析結果正常731例，異常57例。

2.2.1 TCT檢測結果與HPV檢測結果的比較788例患者中，TCT檢查異常68例（8.63%）；HPV檢測陽性結果166例（21.07%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=160.139，Kappa=0.396，P＜0.05），表明兩種檢測方法一致性較差，HPV的陽性檢出率高于TCT，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 TCT結果與HPV結果比較

2.2.2 TCT結果與DNA倍體分析結果比較788例患者中，TCT檢查結果異常68例（8.63%），DNA倍體分析結果異常57例（7.23%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=150.884，Kappa=0.436，P＜0.05）。表明兩種檢測方法一致性較差，兩種檢測方法的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 TCT結果與DNA倍體分析結果比較

2.2.3 HPV結果與DNA倍體分析結果比較788例患者中，HPV檢測結果陽性166例（21.07%）；DNA倍體分析結果異常57例（7.23%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=60.125，Kappa=0.231，P＜0.05）。表明兩種方法一致性較差，HPV陽性檢出率高于DNA，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 HPV結果與DNA倍體分析結果比較

3 討論

目前國內對宮頸癌的篩查中同時檢測TCT、HPV和DNA倍體分析的文章較少。該次回顧性分析數據主要是選取同時檢測TCT、HPV和DNA這3項檢查的標本，在TCT診斷的陽性結果標本中，陽性分布的年齡段主要集中在31～55歲，這與原新麗等[12]報道一致。針對越來越年輕的發(fā)病率，將30歲以下的人群單獨列一組，結果發(fā)現在≤30歲、31～55歲及＞55歲人群中對于TCT和HPV的檢測結果相近；但在DNA的結果分析中，31～55歲組的DNA陽性率高于≤30歲組，因此要加強對這一年齡段人群的宮頸癌篩查。結合以往的資料也顯示31～55歲人群是高發(fā)人群。3種檢測方法的比較：HPV的陽性檢出率高于TCT陽性檢出率（χ2=160.139，Kappa=0.396，P＜0.05）；TCT的 陽 性 率 高 于DNA倍 體 分 析 陽 性 率（χ2=150.884，Kappa=0.436，P＜0.05）；HPV陽性檢出率高于DNA倍體分析陽性率（χ2=60.125，Kappa=0.231，P＜0.05）。該次回顧性分析788例標本，HPV陽性166例，總陽性率21.1%，HPV的陽性檢出率均高于TCT和DNA，這與熊繼永等[13]報道的HPV總陽性率20.29%相符。HPV的檢出率偏高，但大部分的HPV感染可自行修復，有時也與人體的抵抗力有關，因此在臨床上有時存在著過度治療的情況，綜合上述在臨床實踐中要綜合分析，有條件地最好同時進行這3個檢測方法，可以減少漏診率同時也可以避免過度診斷、過度治療。

相比較于傳統(tǒng)的涂片法，涂片細胞厚，特別是當黏液和血液比較多的時候涂片更加難以診斷。隨著TCT技術的發(fā)展，該院用的是安必平的試劑和儀器，用細胞處理液處理保存瓶中的試劑，去除了很大一部分的黏液、血液和其他雜質，留下宮頸細胞進行沉降、制片、染色及封片，做出來的片子細胞分布均勻，染色鮮亮，比較好診斷。其結果受主觀診斷水平影響較大，也跟醫(yī)生的取材質量有關系，而且重復性較差，因此TCT檢測在宮頸病變的早期診斷中存在一定的漏診率和誤診率[14]。

全自動細胞DNA倍體定量分析技術，是指宮頸細胞學從以前形態(tài)學的描述向細胞定量分析的描述[15]。DNA倍體在國際上已經是公認的腫瘤細胞形成的一個生物標記[16]，異倍體細胞圖像分析是在宮頸癌的診斷上判斷惡性程度，異倍體細胞數量越多，惡性程度就越高。近年來DNA倍體定量分析技術被許多醫(yī)院及臨床檢測機構應用于宮頸癌及癌前病變的檢測[17]。異倍體細胞的出現直接表明檢測細胞在結構上及染色體數目上均發(fā)生了改變，是細胞惡變的早期表現之一。DNA異倍體的檢測主要是檢測DNA，將保存瓶中的細胞處理后，制片，通過固定、酸化、染色和封片，制好片后在設定好的掃描儀中掃描片子，該研究設定掃描8 000個細胞，從掃描的細胞中清除重疊的細胞還有一些雜質細胞，將系統(tǒng)分析出來的DI＞2.5的細胞仔細分析，辨別。但是臨床操作上要注意細胞再前處理中一定要混勻，因為是手工制片，在制片的過程中細胞要混勻注意細胞分散液要適量，這樣做出的片子才會細胞分散均勻，重疊少。

HPV是指的人乳頭瘤病毒，在潮濕溫暖的環(huán)境中較容易滋生，HPV病毒分為高危型、中危型和低危型。持續(xù)的高危型感染會導致宮頸癌的發(fā)病率增高。宮頸癌發(fā)生一定伴隨著HPV的感染，但從HPV感染到發(fā)展到宮頸癌一般需要7~10年[18]。大多數HPV感染為暫時性的可自行恢復。2012年美國國立綜合癌癥網絡公布的《宮頸癌篩查臨床試驗指南》將HPV聯合TCT檢測作為30～65歲女性宮頸癌的主要初篩方法[19]。臨床將早發(fā)現、早診斷和早治療作為預防和檢測宮頸癌的方法，這樣降低宮頸癌的發(fā)病率和病死率[20]。HPV在檢測中特別是要注意實驗室污染的問題，特別是在第一步混勻吸取樣本和最后開蓋點樣時，例如該科室使用的安必平的試劑，最后需要將PCR的產物開蓋點樣，這一步要特別注意氣溶膠的產生，防止實驗室的污染。

綜上所述，31~55歲人群應重視宮頸癌的篩查，HPV的陽性率比TCT及DNA倍體分析的高，臨床需結合TCT及DNA倍體分析的結果綜合考慮，避免過度治療。但該次回顧性研究由于缺乏病理診斷的結果，只是將這3種檢測方法自相比較，在今后的研究中將積累更多的臨床病例與病理診斷結果，比較每種方法的靈敏性，各自的特異性和病理符合率。