JAK2-STAT3通路介導(dǎo)缺血后處理心肌保護(hù)作用的初步研究*

夏大川 田軼魁 吳志浩 魏民新

在長時(shí)間缺血期后的再灌注早期進(jìn)行短暫的、間歇性的缺血和再灌注，即缺血后處理，可以產(chǎn)生和缺血預(yù)處理類似的心肌保護(hù)作用[1]。缺血后處理可有效縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌頓抑，加快心肌功能恢復(fù)，降低再灌注早期心律失常的發(fā)生。目前關(guān)于缺血后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。JAK-STAT通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，其可將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[2]。研究表明JAK2-STAT3通路在缺血預(yù)處理心肌保護(hù)作用中具有重要作用[3-4]。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察JAK2-STAT3通路在缺血后處理心肌保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料 健康雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量230～280 g，購自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。紅四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazolium，TTC）購自中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司，伊文思蘭（Evans blue，EB）購自中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司，用生理鹽水配成2%的濃度備用。Ag490（JAK2－STAT3通路阻斷劑）購自sigma公司，TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)盒購自武漢博士德生物工程有限公司。數(shù)碼相機(jī)，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，小動物呼吸機(jī)，小動物心電圖儀。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動物模型及分組 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mg/g）麻醉并固定于實(shí)驗(yàn)臺上，氣管插管連接小動物呼吸機(jī)。在大鼠四肢皮下及胸前插入針性電極，連接小動物心電圖儀。左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包膜，充分暴露心臟。以6-0無損傷線在左冠狀動脈前降支分支下約3 mm處穿一結(jié)扎線，已備結(jié)扎。結(jié)扎時(shí)采用直徑0.2 cm的細(xì)塑料管穿過結(jié)扎線用止血鉗夾緊。心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段弓背抬高為結(jié)扎成功。模型建立成功后大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，其中6只檢測心肌梗死面積，6只檢測心肌細(xì)胞凋亡。缺血再灌注（I－R）組：缺血30 min，再灌注120 min。缺血后處理（Post）組：缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前實(shí)施缺血后處理（灌注10 s，缺血10 s）3個循環(huán)。缺血后處理＋AG490（Post＋AG490）組：缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前實(shí)施缺血后處理3個循環(huán)，并于再灌注前5 min靜脈注射AG490（3 μg/g）。

1．2．2 標(biāo)本采集 心肌再灌注120 min后，結(jié)扎線打結(jié)，靜脈注射2%伊文思蘭1 mL，迅速取出大鼠心臟置于－20℃冰箱快速冷凍，用于檢測心肌梗死面積；心肌再灌注120 min后，取左室心尖部全層心肌標(biāo)本，用中性福爾馬林固定，用于檢測心肌細(xì)胞凋亡。

1．2．3 心肌梗死面積測定 自心尖向心底將左室切成厚2 mm的切片。在切片中，藍(lán)染區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，非藍(lán)染區(qū)為危險(xiǎn)區(qū)；梗死心肌呈灰白色，非梗死心肌呈磚紅色。將所有切片置于2%TTC中，37℃避光孵育30 min，然后用生理鹽水沖去游離染料，10%甲醛固定。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算左室總面積（LV）、危險(xiǎn)區(qū)面積(area at risk，AAR)及梗死面積（infarct size）。以AAR/LV表示心肌缺血程度，infarct size/AAR表示心肌梗死程度。

1．2．4 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測定 心肌標(biāo)本固定后常規(guī)石蠟包埋和切片，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）測定心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。具體方法為：將石蠟切片脫蠟、水化，在PBS（0.01 mmol/L,pH7.4）中孵育8 min，加入蛋白酶溶液于37℃孵育60 min，再加入0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液200 μL，350 W微波照射5 min后PBS振洗2次，每次5 min，配置TUNEL反應(yīng)液，冰上保存。將切片再次用PBS振洗2次，每次5 min后滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃暗室孵育60 min，加PBS，熒光顯微鏡下觀察染色，加50 μL POD溶液，37℃濕化孵育60 min，再用PBS洗3次，每次5 min。滴加DAB底物顯色。顯色后用甲基綠復(fù)染，然后脫水封片。每張切片隨機(jī)取6個高倍鏡視野，檢測每個高倍鏡視野下調(diào)亡細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)。凋亡指數(shù)為100個細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞核的個數(shù)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 3組心肌梗死面積比較3組AAR/LV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Post組infarct size/AAR低于I-R組和Post＋AG490組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組心肌梗死面積比較 （n=6，%±s）

表1 3組心肌梗死面積比較 （n=6，%±s）

*P＜0．05

I-R組（1）Post組（2）Post+AG490組（3）F 44.0±4.4 48.0±3.1 44.0±3.8 1.392 58.0±5.3 37.0±3.7 55.0±3.8 41.741*組比（1）∶（2）（2）∶（3）（1）∶（3）q 3.46*3.12*0.52統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別AAR/LVinfarct size/AAR

2.2 3組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較3組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=374.35，P＜0.05）。Post組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（40±4）低于I-R組（73±6）和Post＋AG490組（71±3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q分別為34.47和32.38，均P＜0.05）。

3 討論

缺血后處理是由Zhao等[1]于2003年提出，他發(fā)現(xiàn)在心肌缺血結(jié)束后再灌注時(shí)先給予多次短暫停灌、復(fù)灌處理，具有與缺血預(yù)處理相似的心臟保護(hù)作用。因再灌注具有可預(yù)知性和可控制性的特點(diǎn)，且操作簡單方便，故缺血后處理具有更直接的臨床應(yīng)用價(jià)值[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可以刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生多種內(nèi)源性物質(zhì)，通過心肌細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血后處理可以顯著降低再灌注120 min后心肌梗死面積并減少心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。可見，缺血后處理具有強(qiáng)大的心肌保護(hù)作用。

多年來對于缺血后處理的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路在其心肌保護(hù)作用中具有重要地位。Tsang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理心肌保護(hù)作用主要通過再灌注損傷存活激酶（RISK）途徑來實(shí)現(xiàn)，而PI3K/Akt通路是該途徑的關(guān)鍵酶。JAK-STAT通路主要由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族組成，其中JAK是STAT的上游共有激酶，它廣泛參與了細(xì)胞應(yīng)激、生長、增殖、分化和調(diào)亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。缺血預(yù)處理可以激活JAK2-STAT3通路，上調(diào)24 h后COX-2及iNOS等保護(hù)蛋白，發(fā)揮延期保護(hù)作用[8]。Kerstin等[9]在小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)STAT3在缺血后處理心肌保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示再灌注前5 min靜脈注射AG490使缺血后處理的心肌保護(hù)作用消失，證實(shí)了缺血后處理心肌保護(hù)作用與JAK2-STAT3通路關(guān)系密切。

缺血再灌注損傷的許多重要機(jī)制都是發(fā)生在再灌注開始階段。缺血后處理的保護(hù)作用是通過激活再灌注開始階段心肌內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，抑制損傷機(jī)制發(fā)揮作用。本研究的結(jié)果顯示JAK2-STAT3通路在這一過程中發(fā)揮了重要作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理具有長期心肌保護(hù)作用[10]。而缺血后處理長期保護(hù)作用的分子機(jī)制及是否與JAK2-STAT3通路有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

[1]Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et a1．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(1):H477.

[2]Darnell JE.STATs and gene regulation[J].Science,1997,277(5332):1630-1635.

[3]Xuan YT,Guo Y,Han H,et a1.An essential role of the JAK-STAT pathway in ischemic preconditioning[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(16):9050-9055.

[4]Smith RM,Suleman N,Lacerda L,et al.Genetic depletion of cardiac myocyte STAT-3 abolishes classical preconditioning[J].Cardiovasc Res,2004,63(4):611-616.

[5]Laskey WK.Brief repetitive balloon occlusions enhance reperfusion during percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction:a pilot study[J].Catheter Cardiovas Interv,2005,65(3):361-367.

[6]Staat P,Rioufol G,Piot C,et al.Postconditioning the human heart[J].Circulation,2005,112(14):2143-2148.

[7]Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al.Postconditioning:a form of"modified reperfusion"protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway[J].Circ Res,2004,95(3):230-232．

[8]Barry SP,Townsend PA,Latchman DS,et al.Role of the JAK-STAT pathway in myocardial injury[J].Trends Mol Med,2007,13(2):82-89.

[9]Kerstin B,Astrid B,et a1.Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in aged and STAT3-deficient mice[J].Circ Res，2008,102(1)：131-135.

[10]Mykytenko J,Kerendi F,Reeves JG,et al.Long-term inhibition of myocardial infarction by postconditioning during reperfusion[J].Basic Res Cardiol，2007,102(1):90-100.