蛇床子素對大鼠心室肌細胞鈉通道的影響

許正新, 鄭　雪, 朱　磊

(揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001)

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蛇床子素對大鼠心室肌細胞鈉通道的影響

許正新, 鄭雪, 朱磊

(揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的探討蛇床子素對大鼠心室肌細胞鈉離子通道電流(I(Na))的影響。方法采用Langendorff 裝置，恒壓恒溫灌流及酶解消化等方法對大鼠心肌細胞進行分離和處理。應用膜片鉗技術，觀察給予不同濃度蛇床子素(Ost)后鈉離子通道電流特征的變化。結果Ost(>100 μmol/L)能明顯抑制鈉電流，其作用呈濃度依賴性(500 μmol/L幾乎完全阻斷)和時間依賴性(10 min左右抑制力達到最強)。100 μmol/L和300 μmol/L Ost使鈉電流I-V曲線明顯上移，峰值鈉電流(-29.8±4.21) pA/pF分別降為(-20.1±3.7) pA/pF和 (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.05)，但激活電位和峰電位沒有改變。對于鈉通道失活曲線，不同濃度的Ost能使其向超級化方向移動，V(1/2)(空白，100 μmol/L，300 μmol/L)分別為(-81.10±0.35)、(-91.62±1.06)、(-100.60±0.21) mV (P<0.01)。Ost還能顯著延長鈉通道失活后恢復時間，τ(空白，100 μmol/L，300 μmol/L)分別為(15.09±0.78)、(23.41±1.23)、(31.62±0.97) ms (P<0.01)。結論Ost對大鼠心室肌鈉通道電流有明顯的抑制作用。

關鍵詞:蛇床子素; 鈉通道; 心室肌; 大鼠; 膜片鉗

蛇床子素，又名甲氧基歐芹酚 (Ost)，是從傘形科蛇床子屬植物蛇床的果實中提取的一種香豆素類化合物，化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高(約1%)的一種烴基香豆素類有效化學成分[1]。研究[2-4]報道, Ost具有降低血壓、抗心律失常、抑制心臟、擴張血管等一系列心血管藥理作用。此外，該藥對免疫系統、神經系統也能產生一定影響[5-6]，同時具有抗菌[7-8]、止癢[9-12]等效應。本研究探討蛇床子素對大鼠心室肌細胞鈉離子通道電流(INa)的影響，現報告如下。

1材料與方法

1.1動物

SD大鼠(200～300 g)，揚州大學比較醫學中心提供，雌雄不拘。

1.2藥品與試劑

蛇床子素購自成都普思生物科技有限公司，HEPES、牛磺酸、葡萄糖購自美國Sigma公司，膠原酶Ⅱ購自Worthington公司，其余均為國產分析純。

1.3溶液配制

臺氏液(mM): NaCl 135; KCl 5.4; MgCl21; CaCl21.8; HEPES 5; NaH2PO40.33; glucose 10; pH值用 NaOH調至7.30～7.40。無鈣臺氏液：臺氏液中去除CaCl2即可。酶液: 無鈣臺氏液中加入0.4 g/L膠原酶Ⅱ, 1g/L的BSA和30 μmol/L的CaCl2。

KB液(mM): L-glutamic acid 70; KCl 25；taurine 10; NaH2PO410;

HEPES 5; glucose 11; EGTA 0.5(用KOH 調pH至7.30～7.40)。

細胞外液(mM): NaCl 5; CsCl 140; MgCl21; CaCl21; CoCl21; glucose 10; HEPES 10 (用CsOH調pH至7.30)。電極內液(mM): CsCl 133; NaCl 5; TEACl 20; EGTA 10; HEPES 10; MgATP 5 (用CsOH調pH至7.2)。

1.4大鼠心室肌細胞分離

整個大鼠心室肌細胞分離過程參照文獻[13]并略作改進。大鼠腹腔注射肝素2 000 IU/kg, 約15 min后繼續腹腔注射2%戊巴比妥鈉(8 mL/kg)。麻醉成功后開胸迅速取下心臟置于預先以100% O2飽和的4℃臺式液中，常規整理、清洗、固定，經主動脈行Langendorff 灌流。其程序為：先用臺式液經主動脈逆行灌流約1 min，使心臟復跳排出心腔殘留血液，繼之以無鈣臺氏液灌流心臟約8 min，直至心臟停跳為止。最后用預先以純氧飽和的酶溶液50 mL循環灌流20～30 min，直至心臟變得柔軟、松弛，流出液渾濁并呈拉絲狀。整個灌流過程在37℃恒溫、灌流液中持續通純氧的條件下進行。酶解消化結束后分離并剪碎心室組織，在KB液中輕輕吹打以游離出單個心室肌細胞，過濾得到細胞混懸液，貯存于KB液中，靜置2 h后待用。期間重復換液3次。

1.5全細胞膜片鉗記錄

將細胞置于培養皿中靜置10～20 min，待其貼壁后換用細胞外液進行灌流以除去殘存的KB液。使用P-97水平拉制儀拉制玻璃微電極，電極入液電阻保持在2～3 MΩ，選用邊緣完整、橫紋清晰、表面光滑無顆粒感的細胞進行實驗。串聯電阻補償60%。

1.6統計學方法

采用PatchMaster軟件采集所記錄電流，結合使用Origin70和graphpadprism5.1對數據進行轉換分析以及擬合。以SPSS 16.0軟件對實驗數據進行統計處理，所有數據均以均數±標準差表示。顯著性檢驗的標準為P<0.05。

2結果

2.1Ost對大鼠心室肌細胞INa影響的時間依賴性

保持電位-80 mV，給予指令電壓為-30 mV，脈寬50 ms，頻率0.5 Hz的方波單刺激，記錄鈉電流。由于電流記錄之初(0～5 min)，電流大小不穩定，所以不采集此段的數據。5～10 min后電流趨于穩定后觀察給藥前后INa峰值的大小。當100 μmol/L蛇床子素作用10 min之后，INa即明顯減弱(降低31.6%)(圖1A)；隨著藥物劑量的增加，當300 μmol/L蛇床子素作用10 min之后，INa減弱更加明顯(降低58.2%)(圖1B)。使用正常的細胞外液灌流5 min，INa可部分恢復。由此證明，INa的減小是Ost對電流的抑制作用。

2.2Ost對大鼠心室肌細胞INaI-V曲線的影響

在電壓鉗模式下，保持電位-80 mV，給予-70～+40 mV、階躍5 mV、持續時間30 ms的方波串刺激，刺激頻率0.5 Hz，記錄給藥前后的INa(圖2A)，以電流密度對相應的電壓作圖，繪制出INa的I-V曲線(圖2B)。Ost 可使INa的 I-V曲線顯著上移，100 μmol/L和300 μmol/L蛇床子素使峰值鈉電流(-29.8±4.21) pA/pF分別降為(-20.1±3.7) pA/pF and (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.01), 但I-V曲線的形狀、激活電位、峰電位和反轉電位不改變。

圖1　100 μmol/L 和300μmol/L蛇床子素對INa抑制作用的時間依賴性

與對照組加藥前比較, **P<0.01。

圖2100μmol/L 和300μmol/L蛇床子素對INa影響的原始曲線及I-V曲線

2.3Ost對大鼠心室肌細胞INa影響的濃度

依賴性

刺激方案同2.1。采用累積加藥法，分別觀察 10、50、100、200、300、400、500 μmol/L Ost對大鼠心室肌細胞INa的影響(圖3)。當Ost濃度為10 μmol/L和50 μmol/L時，其對INa無明顯作用，但當濃度大于此值時，隨著藥物濃度的增加，對電流的抑制作用也隨之增強，表現出明顯的濃度依賴性抑制現象。

與對照組加藥前比較,**P<0.01。圖3 不同濃度蛇床子素對INa的影響

2.4蛇床子素對INa失活動力學的影響

在電壓鉗模式下，采用雙脈沖刺激法。保持電位-80 mV, 條件脈沖從-140 mV開始逐步去極化至+30 mV，階躍10 mV，持續時間50 ms, 然后再給予去極化至-30 mV, 持續時間25 ms的測試脈沖，分別引導出給藥前后INa的失活電流，以相對電流I/Imax對各膜電位作圖，采用Boltzmann方程I/Imax =1/{ 1 + exp [ (V-V1/2)/k ] }進行擬合，得到穩態失活曲線，其中V1/2代表50 %通道失活時的條件脈沖電壓, k為斜率因子。Ost能使INa的失活曲線顯著左移，即向超極化方向移動，100 μmol/L 和300 μmol/L蛇床子素使V1/2由用藥前的(-81.10±0.35) mV分別變為(-91.62±1.06) mV和 (-100.60±0.21) mV (n=10,P<0.01)，k從(9.95±0.31) mV變為(9.93±0.18) mV(n=10,P>0.05)和(12.70±0.94 ) mV (P<0.01)。所以，Ost可明顯改變INa的失活動力學特征，加快INa的失活。見圖4和表1。

2.5蛇床子素對INa失活后恢復動力學的影響

在電壓鉗模式下，采用雙脈沖刺激法，保持電位為-80 mV, 給予去極化至-30 mV的刺激，持續30、5 ms后，再給予去極化至-30 mV、30 ms的刺激，前后2個脈沖的間隔時間以5 ms的幅度逐漸增加，共20個脈沖。分別引出用藥前后INa的復活電流，以相對電流I/Imax對時間間隔作圖，用指數方程I/Imax=1-exp(-t/)擬合。t為兩脈沖之間的時間間隔，為滅活后再激活(61.8%)的時間常數。Ost能使INa的失活后恢復曲線顯著右移，由給藥前的(15.09±0.78) ms變為(23.41±1.23) ms和(31.62±0.97) ms(P<0.01)。Ost可明顯改變INa的失活后恢復動力學特征，使INa從失活態向激活態轉變的時間延長。見圖5和表1

圖4　蛇床子素對INa失活曲線的影響

與空白相比, *P<0.05, **P<0.01。

與對照組加藥前比較, **P<0.01。

圖5蛇床子素對INa失活后恢復曲線的影響

3討論

目前有關Ost對離子通道影響的報道還較少，袁春華等[10]證實了Ost能抑制多種鈣通道亞型并表現出不同的親和力。近年來，隨著電生理技術的發展，尤其是膜片鉗技術的應用，使人類有能力從分子水平來探討離子通道的結構和功能，以及其與疾病的關系。研究表明，心肌細胞上離子通道與很多心血管系統疾病有相關性。

鈉通道是選擇性允許Na+跨膜通過的離子通道，主要是電壓門控離子通道，其功能是維持細胞興奮性及其傳導。在心臟、神經和肌肉細胞，動作電位始于快鈉通道的激活，鈉離子內流引起動作電位的0期去極化。INa異常會導致一系列的心律失常。本實驗采用全細胞膜片鉗技術觀察了蛇床子素(Ost)對大鼠心室肌細胞INa幅值、I-V曲線及其失活和恢復動力學的影響。結果表明，Ost可以濃度依賴性地抑制鈉電流。其中，100 M Ost可使INaI-V曲線明顯上移，但并不改變I-V曲線的激活電位、峰電位和反轉電位，提示Ost在不同膜電位水平對INa具有均勻一致的抑制作用。Ost使INa的失活曲線顯著左移，即向超極化方向移動，加快鈉通道的失活。而對失活后恢復曲線則使其顯著右移，使INa從失活態恢復的時間延長。此外，Ost對鈉電流的抑制作用還具有濃度依賴性，在100～500 μmol/L范圍內，隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強。此分子水平的實驗結果與整體實驗[3，14]中Ost的作用相一致，可以部分解釋其抗心律失常效應的作用基礎，從而為該藥及其同類藥物的進一步開發、應用及指導臨床合理用藥提供相應的理論依據。

關于受Ost影響的鈉通道的狀態，綜合整個實驗結果，作者發現Ost對激活、失活、失活后恢復等過程均有影響。說明該藥不僅作用于鈉通道的靜息狀態或激活狀態，對通道的失活也有抑制作用，故Ost對鈉通道的不同狀態都是存在一定的抑制作用，只是親和力不同或者結合與解離的速度不同[15]。作者通過直接在細胞外液中加入藥物來觀察Ost對鈉通道的影響，還可以考慮通過在電極內液中加入同樣濃度的Ost來比較內、外部給藥作用的差別，以此來判斷藥物與通道的結合位點是更靠近膜內側還是外側。

Ost為中國傳統中藥蛇床子中的提取物，研究發現其對心血管系統的影響，包括其抗心律失常作用。Ost對氯仿誘發的小鼠室顫、CaCl2誘發的大鼠室顫均有明顯的預防作用，對烏頭堿誘發的大鼠心律失常也有療效。Fabio F等[16]實驗結果表明，Ost對血管平滑肌細胞的Ca2+通道具有抑制作用。關于Ost的確切作用機制或其對離子通道的直接影響尚不清楚。由于心律失常發生的機制非常復雜，有眾多的離子通道參與，臨床上的一系列抗心律失常藥物可分別從鈉通道、鉀通道和鈣通道等途徑發揮相關的作用。因此，本研究從心肌鈉離子通道方面探討Ost對該通道的影響具有重要的現實意義。

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Effect of osthole on sodium channels of ventricular myocytes in rat

XU Zhengxin, ZHENG Xue, ZHU Lei

(MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of osthole on sodium channel current of ventricular myocytes in rats. MethodsCardiomyocytes were enzymatically dissociated from SD rats by Langendorrf with constant pressure and temperature. Whole-cell patch clamp techniques were used to evaluate the changes of sodium channel current characteristics at different concentrations of osthole. ResultsOsthole (>100 μmol/L) inhibited sodium current in a concentration-dependent (500 μmol/L almost blocked completely) and time-dependent manner (it blocked sodium current quickly and the strongest inhibition appeared 10 minutes later). The I-V curves of the sodium current raised obviously with the peak current density from (-29.8±4.21) pA/pF to (-20.1±3.7) pA/pF and (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.01) at concentration of 100 μmol/L and 300 μmol/L, but the activation potential and peak potential did not change. In addition, osthole at different concentration caused significant hyperpolarizing shifts in voltage-dependent channel inactivation of I(Na). 100 μmol/L and 300 μmol/L Ost shifted the V(1/2) of I(Na) from (-81.10±0.35) mV in control to (-91.62 ±1.06) mV and (-100.60±0.21) mV. Ost could significantly prolong the sodium channel recovery time from inactivation with τ increasing from (15.09±0.78) ms in control to (23.41±1.23) ms and (31.62±0.97) ms (n=10, P<0.01). ConclusionOsthole can significantly inhibit sodium current of ventricular myocytes in rat.

KEYWORDS:osthole; sodium channel; ventricular myocytes; rats; patch clamp

中圖分類號:R 542.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-001-05

DOI:10.7619/jcmp.201607001

基金項目:國家自然科學基金資助項目(NO. 31071171)

收稿日期:2015-11-20