非洲豬瘟病毒及其分子檢測技術研究進展

2021-11-28 23:23:09呂美慧曹際娟李海濤

大連民族大學學報 2021年1期

呂美慧，曹際娟，李海濤，郭昕，劉俊

(1.大連工業大學食品學院，遼寧大連116000； 2.大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116605；3.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051； 4.成都海關技術中心，四川成都 610041)

1 流行現狀分析

ASF最早于1921年在肯尼亞暴發，隨后相繼擴散至歐洲、中美洲、非洲和亞洲等多個國家。自2018年以來先后傳播到蒙古、越南、柬埔寨、老撾、朝鮮、菲律賓、緬甸、韓國、印度尼西亞等亞太國家。由該疫病的傳播范圍可以發現，此病毒可以不受地域限制進行大范圍傳播，傳染性強，世界上所有開展養豬業的國家均有感染該病毒的風險。2018年8月3日，經中國動物衛生與流行病學中心確診，ASF在我國沈陽首次發現[10]。隨后在江蘇、浙江等各個省份也陸續爆發。目前疫病仍在持續中[11]。2019年3月起豬肉價格快速上漲[12]，人民生活受到一定影響。由此可見，與往年爆發的生豬疫病、禽流感等不同，ASF的傳播范圍更廣，負面影響更大、程度更深，人民損失更重。

據中華人民共和國農業農村部報導，2020年以來，全球共有26個國家和地區發生了2197起家豬和7238起野豬共計9435起非洲豬瘟疫情。可見非洲豬瘟的傳播仍在繼續，對ASF的防控工作也勢在必行。

2 ASF檢測技術研究進展

由于ASFV的感染機制極為復雜，基因型多，目前尚未研制出有效的疫苗，只能通過捕殺患病豬切斷傳染源，無害化處理，從而控制疫病傳播[13]。但這一方法會造成巨大的經濟損失，因此對可能患病的豬群應進行早期ASFV檢測從而避免擴大傳染尤為重要。ASFV的快速檢測主要分為兩大類：一類是分子生物學檢測，一類是免疫學檢測。

2.1 分子生物學檢測

2.1.1 常規PCR

PCR即聚合酶鏈式反應，是一種用于擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可以看作是生物體外的特殊DNA復制[14]，PCR技術具有特異性強、靈敏度高、簡單、迅速、對樣品的純度要求低等優點。

LUO Yuzi,Atim Stella A等[15]根據GenBank中所有ASFV的vp72基因序列的高度保守區，設計了一對特異性引物，建立了一種PCR檢測方法。實驗結果表明，檢測限為每次反應60個DNA拷貝。特異性實驗未觀察到非ASF的擴增信號。對來自不同地理區域的14株代表I、V、VIII和IX基因型的14株ASFV進行檢測與OIE推薦的方法相比具有足夠的靈敏度與準群性。多序列比對表明，本研究中使用的引物具有足夠的保守性，足以覆蓋這些基因II型菌株，可以靈敏、通用地檢測ASFV。

2.1.2 實時熒光定量PCR

我國在一段時期中的經濟發展理念是先發展，之后再進行治理，這種模式雖然能夠取得一定的經濟效益，但是這也在一定程度上對生態造成了破壞。而隨著生態環境的進一步惡化、水土流失和土地荒漠化的問題更加突出。因此，應該采取一定的措施進行營林護林工程的建設。在十八大的會議上，我國提出了“五位一體”建設規劃，其中比較重要的內容是綠色發展的理念，這個理念的提出充分體現了我國進行生態文明建設的決心和改善生態環境建設的目標。對林地進行管理的強化不僅能夠提升林場的經濟效益，同時還能在一定程度上實現林業規模的擴大，為實現生態文明和經濟建設提供堅實的基礎。

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[16]。實時熒光PCR有效解決了常規PCR只能終點監測的問題，使PCR技術得到進一步優化[17]。

曾少靈[18]等，依據ASFV的VP73基因保守序列，設計了一對特異性引物建立了ASFV實時熒光PCR檢測方法。與OIE推薦用于檢測ASFV的實時熒光PCR和普通PCR方法進行比對，靈敏度與OIE熒光PCR方法相當，但比普通PCR方法高出至少10倍,最低檢測限可達10拷貝/uL。通過對大量樣品的檢測得到此方法對ASF的各基因型具有普遍適用性。臨床試驗結果與OIE結果一致。

多重熒光定量PCR，是在PCR反應體系中加入2對或2對以上引物，達到同時擴增出多個DNA片段的目的，反應原理，反應試劑和操作過程與PCR大致相同[19]。多重熒光定量PCR為臨床樣品中多重病毒基因的同時檢測提供了一種快速、敏感和特異的技術手段。多種病原體在同一反應管內同時檢出，既節約了時間又避免了大量試劑的浪費[20]。

Felicity J Haines等[21]，建立了一種單步、多重、實時的多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法，用于同時鑒別診斷豬瘟病毒(CSFV)和非洲豬瘟病毒(ASFV)以及外源性內控RNA(IC-RNA)。結合單一提取方法引物和探針組合檢測三種靶核酸CSFV、ASFV和IC-RNA。實驗優化后檢測限為5個豬瘟病毒基因組拷貝數和22個單鏈抗體基因組拷貝數。這種檢測方法針對目前所描述的24種ASFV基因型中的8種進行檢測，有良好的特異性與敏感性。

直擴熒光定量PCR即一種無需提取DNA，直接從樣品中擴增ASFV靶基因的一種熒光定量PCR方法。直擴熒光定量PCR采用了高耐受性的DNA聚合酶，不容易受樣品中抑制因子的影響，無需提取核酸，因此從一定程度上降低了交叉污染的可能性，增強了該技術的檢測實用性能。

張彩虹等[22]，根據ASFV的VP72基因序列，設計了一對特異性引物和探針，建立了免提取DNA直接檢測樣品中ASFV的熒光定量PCR方法。結果顯示，對ASFV檢測敏感性可達 1×10-6，與OIE推薦的熒光PCR的檢測敏感相似。特異性實驗與6種其他病毒未出現交叉反應。分別用建立的直擴熒光定量PCR方法和OIE推薦的傳統的熒光定量PCR方法對240 份豬全血臨床樣品進行檢測，結果顯示，240份臨床樣品均未檢出ASFV，該結果與OIE推薦的傳統的熒光PCR的檢測結果一致。由于未對24種基因型進行覆蓋率檢測，此種方法仍有待進一步研究。

2.1.3 微滴式數字PCR

微滴式數字PCR是在PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，每個微滴經PCR擴增后，對每個微滴逐個進行檢測，根據陽性微滴的個數與比例和泊松分布原理即可得出靶分子的起始拷貝數[23]。新型的微滴數字PCR完全可以應用于ASFV的檢測并且具有更高的靈敏度，并且不依賴內參基因與Ct值即可確定靶分子的數目。

原霖等[24]根據ASFV的P72基因序列，設計了一對特異性引物和探針，建立了微滴數字PCR技術，并與OIE提供的PCR技術進行對比。結果顯示，該方法的最低檢測限可達0.8拷貝·μL-1，敏感性高于PCR，特異性實驗顯示不與豬常見的6種病毒發生交叉反應，而且重復性較好。用微滴數字PCR與qPCR技術分別對78份臨床病料進行ASFV的檢測，兩種檢測方法得到的結果相同，此方法同樣未對24種基因型進行覆蓋率檢測，所以仍有待進一步研究。

2.1.4 環介導等溫擴增法(LAMP)

環介導等溫擴增法是一種新型的恒溫核酸擴增方法，是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下(63 ℃左右)保溫30～60分鐘，即可完成核酸擴增[25]。LAMP與PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環等過程，是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強等特點。可不依賴任何專門的儀器設備而實現快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。

WANG Deguo，YU Jianghan等[26]，通過設計了以ASFV 的P10基因為靶點的引物，優化反應體系，建立了ASFV的LAMP技術。結果表明，LAMP技術能夠準確、特異地檢測出ASFV，檢出限為6拷貝·μL-1。此技術可對ASFV的一部分基因Ⅱ型與一些未在基因庫中查到的基因型有特異性。采集了240份烹調豬肉樣品。其中，我們研制的ASFV核酸實時燈檢測法和目測燈法均未檢測出陽性，與OIE推薦的傳統的熒光PCR的檢測結果一致。

2.1.5 重組酶聚合酶擴增(RPA)與重組酶介導核酸擴增(RAA)

重組酶聚合酶擴增，重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物。當引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物[27]。

重組酶介導核酸擴增技術，是一種利用重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶在等溫條件下進行核酸擴增的技術，5-20分鐘就可實現儀器擴增。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶[28]。

FAN Xiaoxu, LI Lin等[29]，以ASFV的 B646L基因p72為靶點分別設計了一對特異性引物，對兩種基于重組酶的等溫擴增法RPA法和RAA法進行了評價。結果表明，RPA和RAA的分析靈敏度分別為每次反應93.4和53.6拷貝，且不與其他非ASFV有交叉反應。它們對所有24種ASFV基因型都具有普遍的特異性。收集了152份ASFV樣本。比較了實時RPA/RAA檢測與實時PCR檢測的性能。實時RPA/RAA與實時PCR檢測結果的一致。但相較于PCR，RAA與RPA仍存在假陽性的結果并且靈敏度較低。

2.2 免疫學檢測

ELISA法即酶聯免疫吸附技術，利用抗原抗體之間專一的共價結合的特性，對檢體進行檢測[30]。此方法適合于大量動物群體樣本檢測的需要,是當前在動物疫病的檢疫和監測中應用最為廣泛的免疫學檢測技術[31]。

膠體金試紙條技術是采用膠體金免疫層析技術研制而成，該技術是在免疫滲透技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術[32]。通過抗原抗體結合，并利用膠體金呈現顏色反應，檢測抗原抗體。但是，目前為止，未見采用免疫學方法檢測非洲豬瘟病毒的研究報道。

3 結語

ASF是一種急性、熱性的傳染病，在豬群中可大范圍傳染，為防止此疫病在中國進一步流行，加強對此病毒檢測調查和主動監測排查工作刻不容緩。OIE推薦的檢測方法包括病毒分離、熒光抗體檢測以及常規和實時PCR檢測[33]。由于病毒分離過程復雜、耗時長，通常用于確證診斷和分子研究。中國流行的ASFV屬于強毒株，感染豬一般在未產生抗體或少量抗體時已經死亡，并且在臨床癥狀出現的兩天前，受ASF感染的豬大量散播病毒[34]，所以當前檢測主要針對抗原進行。在病原學檢測技術中，LAMP需要四個甚至更多的引物，引物設計通常十分復雜。PCR技術具有高靈敏度，特異性，快速的優點，可以在癥狀出現前完成檢測，是目前實驗室常用的檢測方法[35]。