寧夏地區(qū)蛋雞腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及體外藥敏實驗

薛甜霞 張冉 徐源佑 許佳敏 李海娟 王潔 邊海霞

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2021.11.038

摘要：試驗采用腸道剖檢、細(xì)菌分離技術(shù)、細(xì)菌基因組測序與藥敏試驗等方法進(jìn)行探討，首先從剖檢變化、菌落、菌體的形態(tài)、基因測序等方面對病原菌進(jìn)行了鑒定，腸道剖檢過程中可見腸管體積增加，內(nèi)部臌氣，腸內(nèi)容物呈類西紅柿樣和類褐綠色樣。通過染色鏡檢觀察顯示為兩端鈍圓，呈桿狀，藍(lán)紫色。從菌落的形態(tài)學(xué)觀察，TSC-卵黃平板上呈現(xiàn)有白濁環(huán)的圓形的黑色菌落。進(jìn)行序列測定后提示此次分離得到的菌株與產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性較高，其次經(jīng)藥敏結(jié)果說明其對阿莫西林等5種測試藥物高度敏感，對鹽酸土霉素中敏，對硫酸新霉素等3種藥物耐藥。通過對寧夏蛋雞場壞死性腸炎疑似病例的病原及臨床防控研究，此次共分離到一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素與多西環(huán)素對該分離菌株有良好的抑制效果，而磺胺間甲氧嘧啶、硫酸新霉素與地克珠利則對分離菌株無抑制作用。本文以寧夏地區(qū)蛋雞為研究對象，研究場區(qū)出現(xiàn)的壞死性腸炎疑似病例的病原及其針對性敏感藥物，為雞壞死性腸炎的臨床防控提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：壞死性腸炎;產(chǎn)氣莢膜梭菌;臨床防控

產(chǎn)氣莢膜梭菌（又名魏氏梭菌）引起的壞死性腸炎是養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疾病之一，尤其是飼料禁抗后，雞壞死性腸炎作為一種“復(fù)燃疾病”給養(yǎng)禽行業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)。關(guān)于肉雞中魏氏梭菌的致病力、防控措施等都取得一定研究進(jìn)展。但對于產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)中魏氏梭菌的研究還較少。因此，筆者以寧夏地區(qū)蛋雞場出現(xiàn)的壞死性腸炎疑似病例主要致病菌為研究對象，對寧夏地區(qū)蛋雞場展開調(diào)查，以期為場區(qū)臨床用藥和防控提供一定參考方案。

1 方法

本研究將腸道剖檢后采集到的腸內(nèi)容物加入PBS溶液，渦旋震蕩混勻后靜置，吸取上清適量于FT液體培養(yǎng)基中，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。將增菌后的培養(yǎng)物充分搖勻，以超純水進(jìn)行不同濃度梯度稀釋。用涂布棒依次按低濃度至高濃度順序均勻涂布于制備好的平板上，待菌液充分吸收后覆蓋一層TSC選擇性培養(yǎng)基，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。選取疑似菌落接種于FT中培養(yǎng)16～24h，在產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離純化，經(jīng)多次純化培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。將得到的培養(yǎng)物提取DNA，將其作為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：2xPCR-Mix 10μL，模板2μL，10μmol/L上下游引物各0.8μL，補(bǔ)充ddH2O至總反應(yīng)體系為20μL，后執(zhí)行下列反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min;95℃變性45s;55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán);72℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。之后將回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫將測序結(jié)果先進(jìn)行BLAST程序比對，再從中選取相似性較高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將待測試藥物稀釋為相應(yīng)的使用濃度，再用FT液體培養(yǎng)基將菌株復(fù)蘇和培養(yǎng)16～24h。最后將高壓滅菌后的牛津杯均勻放在下層瓊脂平板上，LB-瓊脂培養(yǎng)基與對數(shù)生長期的菌液均勻混合，凝固后于每孔中加入待測藥物，設(shè)置對照孔，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。根據(jù)抑菌圈直徑判定該菌株對測試藥物的敏感性。

2 結(jié)果

在厭氧條件下，從雞壞死性腸炎疑似病例中經(jīng)FT液體培養(yǎng)基與TSC卵黃瓊脂分離純化，并經(jīng)革蘭氏染色觀察可見兩端鈍圓、單排或雙排形式的革蘭氏陽性桿菌，并將分離菌株命名為XM21F。軟件分析后表明測序得到的分離菌株序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌序列的同源性較高，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后顯示XM21F與產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium perfringens）位于同一分支，表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌，進(jìn)一步確定分離菌株的所屬類別。藥敏結(jié)果則顯示分離菌株對阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素、多西環(huán)素這5種藥物高度敏感，對鹽酸土霉素中度敏感，對硫酸新霉素、復(fù)方磺胺嘧啶、復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉這3種藥物耐藥。

3 討論

國內(nèi)外當(dāng)下普遍使用的魏氏梭菌鑒定方法即是采用PCR方法檢測待測細(xì)菌毒素基因^[1]，本次研究將回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行序列測定，經(jīng)分析后確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium perfringens）引起的雞壞死性腸炎是對養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疾病之一，僅次于球蟲對蛋雞的危害，給蛋雞行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失^[2]。伴隨著抗生素的使用標(biāo)準(zhǔn)越來越嚴(yán)格，家禽壞死性腸炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢^[3，4]。抗生素等藥物已成為控制家禽產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的有效治療措施^[5]。然而，由于抗生素耐藥菌的出現(xiàn)和抗生素對微生物菌群的影響^[6]，使雞產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生了嚴(yán)重耐藥性，為臨床治療時選擇用藥帶來了巨大困難^[7]。文章對分離菌株--產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行藥敏實驗，篩選出臨床上對此治療效果較顯著的藥物。結(jié)果顯示，阿莫西林和氨芐青霉素等對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有良好的抑菌效果，而鹽酸土霉素弱于阿莫西林與氨芐青霉素等藥物，地克珠利與硫酸新霉素對該分離菌無明顯抑制作用。根據(jù)文章研究結(jié)果來看，養(yǎng)殖場進(jìn)行雞壞死性腸炎防控時，可以優(yōu)先進(jìn)行病原的藥敏實驗，并根據(jù)結(jié)果選用高敏藥物添加在飼料中，不僅能預(yù)防疾病，降低腸炎發(fā)病率，又可以減少場區(qū)經(jīng)濟(jì)損失，從而保證產(chǎn)蛋率，確保經(jīng)濟(jì)效益的最大實現(xiàn)。Gong等^[8]的研究指出植物乳桿菌與多黏菌擬桿菌通過改善腸道微生物群的組成和代謝途徑、腸道結(jié)構(gòu)等能夠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染。通過此次研究，也發(fā)現(xiàn)場區(qū)發(fā)生的腸炎疑似病例是在產(chǎn)蛋期時出現(xiàn)。對蛋雞而言，產(chǎn)蛋期尤為關(guān)鍵，則對雞壞死性腸炎的防控就顯得尤為重要。因此，在對雞壞死性腸炎進(jìn)行整體防控時，可以多措并舉，如在飼料中添加適量乳桿菌等制劑，同時注重飼養(yǎng)過程中的雞群腸道發(fā)育，則對改善雞群整體健康狀況有良好的促進(jìn)作用，其次處理好雞舍環(huán)境衛(wèi)生，規(guī)范消毒，合理調(diào)整飼養(yǎng)密度，及時通風(fēng)換氣，再用敏感藥物進(jìn)行預(yù)防，就能夠?qū)乃佬阅c炎病例達(dá)到一個有效的綜合防控效果。

4 結(jié)論

從寧夏地區(qū)蛋雞場壞死性腸炎疑似病例中分離到一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，對分離菌株進(jìn)行體外藥敏實驗后，顯示阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素與多西環(huán)素對分離菌株有良好的抑制作用，而鹽酸土霉素對分離菌株的抑制作用則弱于阿莫西林與氨芐青霉素等藥物，硫酸新霉素、地克珠利與磺胺間甲氧嘧啶鈉對分離菌株無抑制作用。

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*通訊作者