Micro RNA 在心力衰竭中的應(yīng)用研究

（天津市第一中心醫(yī)院心血管外科，天津 300192）

心力衰竭（heart failure，HF）是一種由于心排血量不足而不能滿足機(jī)體器官和組織代謝需要引起的復(fù)雜的臨床綜合征[1]，其是由心臟進(jìn)行性結(jié)構(gòu)和功能改變引起的收縮和（或）舒張收縮功能障礙演變而來，主要分為射血分?jǐn)?shù)降低心衰（HFrEF，LVEF＜40%）及射血分?jǐn)?shù)保留心衰（HFpEF，LVEF≥50%）以及射血分?jǐn)?shù)中間心衰（HFmrEF，LVEF 40%～49%）[2]。HFpEF 和HFrEF 具有不同的流行病學(xué)和病因?qū)W特征，與HFrEF 相比，HFpEF 患者年齡較大，女性較多，多有高血壓和心房顫動（AF）病史[2，3]。心衰可能是急性或慢性的，其中慢性心衰占大多數(shù)，許多終末期心臟病患者反復(fù)發(fā)作急性失代償性心衰，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1，4]。盡管心衰的治療取得了長足的進(jìn)步，但心衰的發(fā)病率、死亡率和住院率仍然很高。美國和歐盟數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[5]，心衰的患病率為1%～14%，并且每年大約新增96 萬例新患者。英國數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[6]，2002 年～2014 年心衰患病率為1.5%～1.6%。亞洲的心衰總患病率約為1%～2%，隨著亞洲人口老齡化加速，約有60%全球人口總數(shù)承擔(dān)著心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)估計(jì)，17%～45%的住院心衰患者在入院后1年內(nèi)死亡，5 年后存活率不超過一半[7]。隨著全球人口的老齡化進(jìn)程，心衰的發(fā)病率和患病率仍然上升。心衰作為一個(gè)重大的全球健康問題，面臨著巨大而日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，迫切需要科研工作者加快了解心衰預(yù)測因子，并為診斷/預(yù)后、預(yù)防和治療心衰提供有效參考。MicroRNAs 是一種長度約為21～22 個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼小RNA，通過抑制信使RNA（mRNA）的翻譯或通過誘導(dǎo)特定mRNA 的降解參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。MicroRNAs 與許多人類疾病相關(guān)，包括糖尿病、心血管疾病、肥胖和癌癥等。研究表明MicroRNAs 可能影響HF 發(fā)生和發(fā)展的不同方面，如心肌細(xì)胞凋亡、肥大、纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激和缺氧損傷等[8]。本文就Micro RNA 參與心衰的病理發(fā)生機(jī)制、與心力衰竭生物標(biāo)志物的關(guān)系及其在心力衰竭治療的應(yīng)用前景作一綜述，以期為臨床治療該疾病提供參考。

1 MicroRNA 參與心衰的病理發(fā)生機(jī)制

免疫及炎癥反應(yīng)通過促炎癥細(xì)胞因子參與心衰的發(fā)生發(fā)展，如以C 反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、生長分化因子15（GDF15）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎性因子水平升高為標(biāo)志的全身炎癥和微血管疾病狀態(tài)。炎癥狀態(tài)影響包括心臟在內(nèi)的多個(gè)器官，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血管細(xì)胞黏附分子（VCAM）和E-選擇素表達(dá)上調(diào)，繼而白細(xì)胞浸潤。炎癥因子進(jìn)一步激活心肌的促炎和促纖維化過程，導(dǎo)致心肌細(xì)胞僵硬，代謝重塑和間質(zhì)膠原蛋白沉積[9]。心衰發(fā)生時(shí)機(jī)體外周血及心肌局部活化大量的炎癥介質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子水平的升高及局部炎癥介質(zhì)的增加，兩者都促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙和免疫細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步加劇心肌收縮功能障礙及心衰的發(fā)生[10]。研究顯示[11]，miR-9、miR127、miR-155 和miR-125b 參與促炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而miR-124、miR-223、miR-34a、miR-132、miR-146a 和miR-125a-5p 則通過發(fā)揮抗炎反應(yīng)參與心衰的發(fā)生發(fā)展。“促炎”相關(guān)的microRNA介導(dǎo)心臟炎癥和巨噬細(xì)胞向心肌細(xì)胞浸潤的促肥大信號，Seok HY 等[12]通過構(gòu)造高血壓心臟病小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 是病理性心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo)因子，是導(dǎo)致心臟重塑和衰竭的關(guān)鍵因素。內(nèi)皮源性miR-146a 則通過NF-κB 通路調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕小鼠糖尿病模型的心肌炎癥和纖維化發(fā)生[13]。miR-126 是內(nèi)皮細(xì)胞中最豐富的microRNA，在維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)和血管完整性方面起著關(guān)鍵作用，其丟失會導(dǎo)致血管滲漏、出血、血管完整性喪失及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成能力的損害,而促炎細(xì)胞因子以miR-138依賴的方式降低內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）活性和NO 生成，抑制miR-138 被認(rèn)為有可能通過恢復(fù)NO功能，延緩與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的心衰發(fā)生[14]。

神經(jīng)內(nèi)分泌激活在心衰發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其中以腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）和交感神經(jīng)（SNS）系統(tǒng)為主的交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活被認(rèn)為是心衰過程中重要的病理生理因素。在心臟損傷的背景下，RAAS 和SNS 的不適當(dāng)激活會導(dǎo)致血流動力學(xué)紊亂、過多的循環(huán)容量和過高的心臟后負(fù)荷，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥大和纖維化發(fā)生以及加速心肌細(xì)胞凋亡，加速發(fā)展為心力衰竭[15]。相反，神經(jīng)系統(tǒng)激素，如內(nèi)皮素、心鈉素（ANP）、B 型腦利鈉肽（BNP）、C 型鈉尿肽（CNP）及N-端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）等，其通過利鈉、利尿、血管擴(kuò)張、抗肥大和抗纖維化等發(fā)揮心臟保護(hù)作用。心力衰竭發(fā)生時(shí)，miR-100 和miR-133b 分別在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中被上調(diào)和下調(diào)，miR-133b 在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大中具有重要作用。但是，這些miRNAs 的特定基因靶點(diǎn)上的具體調(diào)控機(jī)制尚未被確定。研究顯示[16]，miR-100 的基因靶點(diǎn)可能為利鈉肽受體3（NPR3）的3'-UTR 端，提示在心力衰竭患者中觀察到的miR-100 的升高可能反映了一種代償機(jī)制，即減弱NPR3 的表達(dá)可延長循環(huán)和組織中基礎(chǔ)鈉尿肽的半衰期。另有研究顯示[17]，miR-125a/b-5p 與易卒中高血壓大鼠主動脈內(nèi)皮素-1 水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-125a/b-5p 靶向結(jié)合前內(nèi)皮素-1 的3'-UTR 端并調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素的表達(dá)。

另外，氧化應(yīng)激通過改變多個(gè)基因的表達(dá)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其也是心衰發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過程，其中活性氧（ROS）水平升高或抗氧化劑防御能力降低是心衰進(jìn)展的重要原因[18]。ROS 是一個(gè)統(tǒng)稱，它包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子O2-和羥基自由基（-OH）。正常生理狀態(tài)下，ROS 可以由以下幾種潛在的來源，如線粒體、質(zhì)膜結(jié)合的NADPH 氧化酶（NOXs）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）及參與氧化還原反應(yīng)的不同酶。已有研究證實(shí)[19]，線粒體DNA 缺失通過增加線粒體活性氧參與了收縮性心力衰竭的發(fā)生。存在于心臟線粒體中的miRNAs，其可顯著調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)，防止ROS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。研究表明[20]，血漿miR-1 水平在心力衰竭時(shí)顯著升高，并與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)；在小鼠心衰模型中，給予抗miR-1 可以顯著降低小鼠的ROS 和氧化應(yīng)激敏感性，并顯著提高心功能。氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞miR-25 水平顯著升高，miR-25 的過表達(dá)通過下調(diào)線粒體鈣單轉(zhuǎn)運(yùn)體和增強(qiáng)心肌細(xì)胞活性來保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化損傷[21]。此外，氧化應(yīng)激顯著上調(diào)miR-200c 的表達(dá)，并通過下調(diào)E 盒鋅指結(jié)合蛋白1（ZEB1）和內(nèi)皮依賴性舒張（EDRs），顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，增加細(xì)胞凋亡和衰老，而通過抑制miR-200c 可促進(jìn)細(xì)胞生長，顯著減少細(xì)胞凋亡[22]。此外，全細(xì)胞色素c 合成酶（HCCS）、Caspase3、環(huán)氧合酶-2（COX-2）蛋白的表達(dá)基本上受miR-200c 的調(diào)控，從而極大地減少了心肌細(xì)胞的凋亡。心力衰竭患者循環(huán)miR17-5p 水平明顯改變，氧化應(yīng)激條件下心肌miR17-5p 水平明顯上調(diào)。過表達(dá)miR-17-5p可引起心肌細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率下降，H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加，拮抗miR-17-5p 可顯著減少心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡，顯著提高心肌細(xì)胞存活率[23]。

心肌間質(zhì)纖維化是心肌損傷修復(fù)的一個(gè)重要標(biāo)志，它與HF 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[24]。細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白是纖維膠原，心衰發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中，膠原蛋白沉積引起心肌間質(zhì)纖維化過程不可忽視。心臟膠原蛋白沉積可能由不同的原因引起：①浸潤的單核/巨噬細(xì)胞釋放的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)有利于成纖維細(xì)胞分化為產(chǎn)生膠原蛋白的肌成纖維細(xì)胞；②微血管炎癥誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖；③壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的促生長激素如內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ和醛固酮等具有促纖維化作用[25，26]。miR-21 富含在衰竭心臟的成纖維細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)ERK-MAP 激酶信號通路，影響成纖維細(xì)胞的生存和激活。拮抗miR-21 可防止壓力超負(fù)荷所致的心臟間質(zhì)纖維化和心功能不全的發(fā)生[27]。miR-29 家族也與心臟纖維化的發(fā)展有關(guān)，通過抑制miR-29 可以增加膠原蛋白沉積，而在心臟損傷后引入miR-29則有利于減少膠原含量。另有研究顯示[28]，心臟中含量最豐富的miR-22 與促纖維化信號、心肌肥大和衰老密切相關(guān)。

總之，在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫及炎癥反應(yīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌激活、心肌間質(zhì)纖維化、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激是一個(gè)相互交錯(cuò)、相互促進(jìn)的復(fù)雜的生理過程，在這個(gè)過程中，龐大的microRNA 家族發(fā)揮著重要的作用。

2 MicroRNA 與心力衰竭生物標(biāo)志物的關(guān)系

BNP 和NT-proBNP 目前被用作診斷心衰并判斷心衰預(yù)后的主要生物標(biāo)志物，另外，循環(huán)中心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白，如肌鈣蛋白T 和肌鈣蛋白Ι，或細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分，凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的循環(huán)水平也反映了心臟損傷和（或）功能障礙的嚴(yán)重程度[1,2,4]。循環(huán)中的miRNAs 作為新的潛在的診斷HF 的新生物標(biāo)志物已經(jīng)成為臨床研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為單獨(dú)使用NT-proBNP 對預(yù)測心衰最有意義，并且顯示出更高的敏感性和特異性，但將microRNA 水平與NT-proBNP 結(jié)合起來可能更能增加心衰診斷價(jià)值[30]。多項(xiàng)研究結(jié)果提示[31,32]，循環(huán)中的miRNAs 可能是心力衰竭患者穩(wěn)定的血液生物標(biāo)志物。多種循環(huán)miRNAs（miR-423-5p、miR-18b、miR-129-5p、miR-1254、miR-675 和miR-622）在心衰患者中表達(dá)上調(diào)，其中miR-423-5p 與心衰的臨床診斷關(guān)系最為密切。有研究顯示[33]，在收縮期心力衰竭的大鼠心衰模型中循環(huán)miR-423-5p 顯著上調(diào)，并與NT-proBNP 和EF 密切相關(guān)。收縮期心衰患者血清miR-320a、miR-22 和miR-92b 水平顯著升高，這些miRNAs 與患者臨床參數(shù)（如血清NTproBNP 水平升高、QRS 增寬、左心室和左心房擴(kuò)張等）相結(jié)合對心衰具有很高的診斷價(jià)值[34]。非缺血性擴(kuò)張型心肌病（NIDCM）和缺血性心肌病（ICM）患者的miR-107、miR-139 和miR142-5p 的表達(dá)水平明顯不同，研究表明[35]，NIDCM 患者miR-142-3p 和miR-29b 水平明顯上調(diào)，而ICM 患者miR-125b 和miR-497 水平明顯下調(diào)，提示不同的miRNA 表達(dá)水平可能對心衰的病因鑒別具有重要的臨床意義。此外，終末期心衰患者循環(huán)microRNAs（miR-30b、miR-103、miR-199a-3p、miR-23a、miR-27b、miR-324-5p、miR-342-3p 和miR-142-3p）的表達(dá)明顯改變，研究表明[36]，高血壓性心衰大鼠血漿miR-16、miR-20b、miR-93、miR-106b 和miR-223 水平變化最為明顯，且與循環(huán)BNP 高度相關(guān)，這些血漿microRNA 均可以潛在地作為HF 的治療效果和疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物。Nair N 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，HFpEF 患者循環(huán)中miRNAs（miR-454、miR-500、miR-1246 和miR142-3p）的表達(dá)水平與HFrEF 患者表達(dá)水平明顯不同，且舒張功能不全時(shí)循環(huán)miR-454 和miR-500 表達(dá)減少，而miR-1246 表達(dá)增加。Wong LL 等[38]和Watson CJ 等[39]研究均提示，在心衰和非心衰患者之間有12 個(gè)顯著不同的miRNAs 水平對照，其中4 種（miR-125a-5p、miR-550a-5p、miR-190a 和miR-638）具有鑒別診斷HFpEF 和HFrEF 的臨床價(jià)值。總之，與單獨(dú)血漿NT-proBNP 水平相比，microRNAs 組成的生物標(biāo)志物組合對HFpEF 和HFrEF 的鑒別價(jià)值更好，而將多個(gè)microRNAs 組合與NT-proBNP 結(jié)合則進(jìn)一步提高了心衰的鑒別診斷能力。

3 MicroRNA 在心力衰竭治療的應(yīng)用前景

大量研究表明miRNAs 在心衰發(fā)生發(fā)展過程中具有舉足輕重的作用，因此，MicroRNA 在心衰中的潛在治療價(jià)值引起了廣大研究人員的重視。盡管目前尚無針對人類患者心臟的基于miRNA 的療法的臨床試驗(yàn)，但在小鼠、小型豬和非人類靈長類動物的心衰模型中，miRNA 的療法表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景[40]。目前應(yīng)用MicroRNA 治療方法主要有以下2種，使用特定AntimiRs 來抑制相關(guān)miRNAs 的表達(dá)水平，或者使用miRNA 模擬物來提高目標(biāo)miRNAs的表達(dá)水平。AntimiRs 是單鏈反義寡核苷酸分子，可以通過與成熟的miRNAs 結(jié)合直接沉默目標(biāo)miRNAs，從而阻止目標(biāo)miRNAs 與靶mRNAs 的結(jié)合。在臨床前動物模型中，長期應(yīng)用AntimiRs 抑制miRNAs 能夠減輕心血管疾病，且沒有毒性證據(jù)[40]。在心肌肥大小鼠模型中，miR-21 在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，使用經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的且能在功能上抑制 miR -21 的 miRNA 拮抗劑（AnagomiR）可顯著減少心肌肥厚并改善心功能，且通過使用AntimiRs 沉默小鼠心臟中的miR-21，心臟ERK-MAP 激酶活性降低，可以減輕小鼠心肌纖維化并改善心功能[41]。另有研究表明[42]，在心衰的發(fā)展過程中，miR-25 的過度表達(dá)與心肌細(xì)胞的鈣攝取能力下降明顯相關(guān)，通過對miR-25 使用設(shè)計(jì)良好的AnagomiR，可以明顯改善受損的心臟功能。此外，在心梗動物模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用于miR-92a 和miR-320 的AnagomiR 通過促進(jìn)血管的恢復(fù)和凋亡信號的抑制從而減小了心肌梗死面積[43]。

miRNA 模擬物是一類人工合成的雙鏈寡核苷酸miRNA 類似物，廣泛用于恢復(fù)心衰相關(guān)的失調(diào)的“保護(hù)性”miRNAs 的表達(dá)水平。在靶細(xì)胞中，它們被切割成功能性的單鏈miRNAs，進(jìn)而與靶mRNA 的3'UTR 結(jié)合，從而抑制其表達(dá)。腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）被廣泛用做RNA 載體。在心臟特異的miR-133 可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，miR-133 的過表達(dá)減少了壓力超負(fù)荷后的心肌細(xì)胞凋亡并改善了心功能[44]。另有研究顯示[45]，miR-133 水平穩(wěn)定的高血壓小鼠模型中，心肌纖維化顯著減少，舒張功能改善，無心肌肥厚發(fā)展。在基于miRNA 的治療廣泛應(yīng)用于臨床之前，需要解決一些重要的問題。AntimiRs 和miRNA 模擬物的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)效應(yīng)尚未完全確定，有必要進(jìn)行長期隨訪研究，以確定幾個(gè)月或幾年后可能出現(xiàn)的任何副作用。AntimiRs 的器官特異性給藥方法目前是具有挑戰(zhàn)性的，需要建立靶向心臟給藥的技術(shù)。然而，由于一個(gè)miRNA 具有多個(gè)靶基因，基于miRNA 的治療可能導(dǎo)致靶基因以外的其他基因產(chǎn)生不利的脫靶效應(yīng)，如miRNA 模擬物的使用導(dǎo)致了與內(nèi)源性miRNAs結(jié)合方面的細(xì)胞內(nèi)競爭，干擾了正常的miRNA 功能，從而導(dǎo)致基因調(diào)控的紊亂。

4 總結(jié)

miRNA 在心力衰竭的諸多病理生理過程中發(fā)揮了極其重要的作用，隨著對心衰的基因?qū)用娴纳钊胙芯浚琺iR-423-5p 等一批miRNA 極有可能成為未來預(yù)測心衰并鑒別心衰病因的關(guān)鍵分子。但目前miRNA 治療仍然停留在動物實(shí)驗(yàn)階段，仍然需要對miRNA 的安全性進(jìn)行更加深入的研究。