警報素在系統性硬化癥發病機制中的作用

（復旦大學附屬華山醫院皮膚科，上海 200040）

系統性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）是一種罕見的自身免疫性疾病，其特征是微血管損傷、皮膚和內臟纖維化以及異常的免疫激活[1]。根據皮膚受累的程度，可分為兩大類：彌漫性皮膚型SSc（diffuse cutaneous SSc，dcSSc），皮膚、肺和其他內臟器官迅速進行性纖維化；局限性皮膚型SSc（limited cutaneous SSc，lcSSc），以血管表現為主，皮膚和器官纖維化進展緩慢。血管病變的臨床表現為指/跖凹陷和潰瘍，而內臟受累多見，包括胃食管反流病、間質性肺疾病和心臟舒張功能障礙。SSc 的確切病因和分子發病機制尚不清楚，越來越多的證據證實了遺傳、環境和免疫因素之間復雜的相互作用在系統性硬化癥的發展中起著重要作用。SSc 發病主要涉及3 大方面，分別為自身免疫異常、血管病變和纖維化。近年來研究顯示[2]，警報素參與SSc 發病。警報素是一種內源性和組成性表達的具有免疫激活活性的蛋白質/肽，由于脫顆粒、細胞損傷或死亡或免疫誘導反應，它們在微環境中釋放。除了在細胞內的生理作用（通常是穩態作用）外，當暴露于細胞外環境時，警報素向宿主傳遞危險信號，觸發局部炎癥反應以及先天性固有/適應性免疫反應。大多數警報素是從凋亡的細胞中被動釋放的，但有些警報素也可以主動分泌[3]。由于嚴重損傷或刺激，警報素激活的信號通路可能會失調，導致病理性炎癥。在SSc 發病過程中，其可能參與血管病變、炎癥和纖維化等環節。本文就警報素的概況、細胞核來源的警報素（HMGB-1、IL-33、IL-1 及受體）、顆粒源性警報素（α 和β 防御素及LL-37）及細胞漿來源的警報素（HSP-70 和S100）在SSc 中的表達和功能作一綜述。

1 警報素的概況

當機體遇到危險事件，如感染、創傷以及保持機體內環境穩定時，機體可以通過一系列的反應來抵抗這些威脅，這些反應被稱為“炎癥應答”。而機體是通過識別一系列的危險因子來抵抗這些危險事件的，病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP）即為主要的外源性危險因子。PAMP，如脂多糖、病毒RNA 等，與免疫細胞表面特定的受體結合，使固有免疫細胞活化，釋放多種細胞因子和炎性介質，發揮免疫或免疫調節作用[4]。研究發現[5]，機體組織創傷時還可產生內源性的危險因子，這些內源性的危險因子即為警報素。在警報素一詞提出之前，為區別病原相關分子模式(外源性危險因子)，曾將內源性危險因子稱為損傷相關分子模式（danger associated molecular patterns，DAMP）[6]。目前臨床認為，外源性病原相關分子模式和內源性警報素共同構成損傷相關分子模式大家族。

1.1 警報素家族成員 警報素家族成員主要包括3 大類[7]：①細胞核來源的，包括高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）、高遷移率族蛋白N1（HMGN1）、IL-33和IL-1α；②顆粒源性的，包括α-和β-防御素、抗菌肽Cathelidin（LL37/Cathelidin related acibility peptide，CRUMP）、嗜酸性粒細胞源性神經毒素（EDN）和麻粒素；③細胞漿來源的，如熱休克蛋白（HSP-60、HSP-70、HSP-90 和HSP-96），S100 蛋白，ATP 和尿酸。

1.2 警報素的生物學特征 目前已鑒定出的警報素家族成員，是一群結構多樣的分子，他們分屬于不同的亞族，并且都具有其他已知的生物學功能。但是作為警報素家族成員，它們具有一些共同的生物學特征：①當發生非程序性細胞死亡時迅速釋放，而程序性細胞死亡時不會產生；②能夠募集和活化具有相應受體的固有免疫細胞，目前備受關注的是其誘導DC 成熟，上調DC 表面MHC 分子和共刺激分子，增強抗原提呈，啟動和促進適應性免疫應答的作用；③在機體發生創傷或感染損傷后，警報素具有促進內皮細胞和上皮細胞增殖、血管生成、營養神經、延伸神經突觸、募集干細胞使其增殖分化等促進組織細胞再生的作用。

2 細胞核來源的警報素在SSc 中的表達和功能

2.1 HMGB-1 及受體 HMGB-1 是一種高度保守、非組蛋白、普遍存在的核DNA 結合蛋白，存在于大多數細胞類型中，是核/轉錄調節因子[8]。HMGB-1 對包括樹突狀細胞在內的白細胞既有趨化作用又有激活作用，因此，它可以誘導固有免疫和獲得性免疫。由于細胞損傷或通過調節分泌，類似于其他“多任務”的警報素，HMGB-1 被釋放到細胞外微環境，獲得細胞因子樣和促炎活性。HMGB-1 激活的信號通路誘導NF-κB 磷酸化，進而導致內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞等產生多種細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-1α 和轉化生長因子β，T 細胞和B 細胞?，F在已經確定HMGB-1 能促進纖維化。在不同的病理條件下，如肺纖維化、腎纖維化和心肌纖維化都觀察到了這一點[9]。Yoshizaki A 等[10]首次發現，SSc 患者血清HMGB-1 和可溶性高級糖基化終產物（soluble advanced glycation end products，sRAGE）水平高于對照組。由于雷諾氏現象后血管缺血和再灌注損傷，高活性氧產生在HMGB-1 水平升高中起作用，因此與HMGB-1/RAGE 誘導的炎癥反應相比，sRAGE 的產生是一個對抗系統。Maugeri N 等[11]研究發現，在SSc 患者的血液中，活化的血小板釋放出大量的微粒子，與中性粒細胞相互作用，促進中性粒細胞自噬，通過這個過程，應激細胞提供合成代謝底物，為其生物能源提供營養，并產生中性粒細胞胞外陷阱；這是一種自身抗原的來源，在自身免疫性疾病發病機制中具有重要作用，如系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎[12]。SSc 患者血液中含有大量網狀細胞和自噬中性粒細胞，研究表明[13]，當注射到NSG 小鼠體內時，從SSc 患者獲得的血小板衍生微粒促進中性粒細胞活化，導致內皮損傷和纖維化；相比之下，從健康對照組血漿中提取的微粒子不會對小鼠的內皮細胞造成損傷。因此，HMGB-1 是SSc 內皮損傷的主要因素。

2.2 IL-33 及受體 白細胞介素-33（IL-33）是IL-1 家族的組織源性核細胞因子，包括IL-1α、IL-1β 和IL-18[14]。在穩態和炎癥期間，內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞樣細胞和肌成纖維細胞中均有表達。在關于IL-33 在SSc 中作用的初步研究中，Yanaba K 等[15]研究了SSc 患者（早期和晚期）和對照組皮膚和內臟器官活檢中IL-33 蛋白表達、IL33 mRNA 和ST2 表達，結果發現IL-33 蛋白在內皮細胞和角質形成細胞中的表達。早期SSc 患者皮膚明顯減少，mRNA 表達正常甚至升高，這被解釋為IL-33 在疾病早期被激活/損傷后被內皮細胞動員；相反，在晚期SSc 患者中，IL-33 蛋白是組成性的，提示IL-33 可能在暴露于環境的組織中作為上皮“警報素”發揮重要作用。此外，“活動期”患者的IL-33 水平明顯高于“晚期”毛細血管鏡檢查的患者，提示在內皮細胞中，其與炎癥細胞的表達密切相關，且早期SSc 中的細胞和肌成纖維細胞提示IL-33 在活躍的微循環紊亂以及SSc 的其他致病機制（如免疫異常和纖維化）中起作用。

同時，Yanaba K 等[15]研究也證明了高血清IL-33 水平與皮膚硬化和肺纖維化的嚴重程度呈正相關，考慮到IL-33 對Th2 反應的增強作用，其認為IL-33 可能促進Th2 淋巴細胞浸潤及Th2 細胞因子的產生，進而導致SSc 皮膚纖維化。Luzina IG 等[16]研究也發現，在SSc 相關肺纖維化患者和特發性肺纖維化患者的肺成纖維細胞中IL-33mRNA 的表達增加。Terras S 等[17]隨后的一項研究僅部分證實了這些發現，該研究結果顯示IL-33 水平的增加與周圍血管的累及（如指狀潰瘍）之間存在顯著聯系。早期SSc 人群代表了研究疾病早期內皮淋巴細胞成纖維細胞相互作用的理想環境，根據評估的功能和血清學特征，在早期SSc 中其他研究標記物未顯示出明顯差異。

2.3 IL-1 及受體 IL-1α 是屬于細胞因子IL-1 超家族的核警報素，由11 種細胞因子組成，其中7 種具有激動作用（IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β 和IL-36γ），4 種具有拮抗活性（IL-1Ra、IL-36Ra、IL-37 和IL-38），可放大和調節免疫反應[18]。基于表達改變或基因多態性，這個家族的一半成員（IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33 和IL-36α）與包括SSc在內的纖維化疾病有關。全基因組關聯研究揭示了編碼IL-1 家族細胞因子的基因與SSc 之間的關聯。人類IL-1α（IL-1A）基因包含硝普鈉（SNP）rs1800587，據報道[19]，在斯洛伐克高加索、日本和中國人群中，該基因與SSc 易感性有關。然而，在最近的一項薈萃分析中[20]，IL-1aRS1800587 多態性似乎與SSc 的風險無統計學聯系。

有研究提出了不同的機制來解釋IL-1α 在SSc中的促纖維化作用，內源性IL-1α 刺激SSc 中IL-6和PDGF 的產生，抑制內源性IL-1α 導致SSc 成纖維細胞中IL-6 和PDGF 的表達水平降低。白細胞介素-6 有多種促生長作用，包括誘導促纖維化基因在體內的表達，增加轉化生長因子β1的產生，調節轉化生長因子β 受體[21]。TGF-β1是促纖維化上皮間充質轉化（EMT）、成纖維細胞增殖、ECM 合成、膠原酶和MMP 抑制的主要調節因子。PDGF 對炎癥細胞和TGF-β1是一種有效的趨化因子。IL-1α 和IL-1β 可促進SSc 患者成纖維細胞和肌成纖維細胞的活力。因此，IL-1 可能參與成纖維細胞-肌成纖維細胞的分化和延長肌成纖維細胞的壽命，這被認為是SSc患者皮膚纖維化的關鍵點。

3 顆粒源性警報素在SSc 中的表達及功能

3.1 防御素 防御素是一種小的富含精氨酸的陽離子肽，具有抗菌活性[22]。人防御素是一類由30 個氨基酸組成的陽離子肽，根據其二硫鍵鍵的不同分為α-防御素和β-防御素兩個亞家族。在人類已知的六種α-防御素中，人中性粒細胞肽（HNP）-1-4 存在于中性粒細胞中，而人類防御素（HD）-5 和HD-6主要在中性粒細胞中表達腸Paneth 細胞、呼吸道和女性生殖道。人類β 防御素（HBDs）是由皮膚和與環境接觸的黏膜表面的上皮細胞表達的。越來越多的證據表明防御素的水平通常不僅在對感染的反應中發生改變，而且在炎癥、血管新生或組織損傷的情況下也發生改變。

SSc 中防御素水平異常的意義尚不清楚，一方面，這可能僅僅是細胞因子微環境的結果，目的是防止感染；另一方面，正如Kuzumi A 等[23]研究表明，其可能在SSc 中具有致病作用，該研究結果發現SSc患者的HBD-2 水平與健康對照組相比顯著降低；與局限性SSc 相比，彌漫性SSc 患者的HBD-2 水平顯著降低；早期dcSSc 患者的HBD-2 水平明顯低于中晚期患者。值得注意的是，與沒有癥狀的患者相比，患有毛細血管擴張癥、凹陷性疤痕和指狀潰瘍的SSc 患者的HBD-2 水平顯著升高。從疾病早期到晚期，HBD-2 水平的增加可能與整個病程中從Th2 到Th1 的變化有關[24]。HBD-2 可能通過其血管生成特性參與SSc 血管病變的發生。HBD-2 在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）和Kaposi 肉瘤病變相關的血管內皮細胞中表達，但在正?；|中不表達。因此，有研究推測[25，其在位于惡性病變內的血管內皮細胞中的表達可能在腫瘤血管生成和腫瘤轉移中起作用。

3.2 LL-37 類胰蛋白酶家族肽是在許多哺乳動物中發現的抗菌肽，LL-37 是迄今為止已知的唯一一種人類類cathelidin。LL-37 由hCAP-18 前體生成，hCAP-18 前體由中性粒細胞中的蛋白酶3 和表皮中的激肽釋放酶5 和7 蛋白水解生成角質形成細胞。LL-37 由多種細胞產生，包括中性粒細胞、巨噬細胞、NK 細胞和皮膚、呼吸道、眼表和腸道的上皮細胞。此外，為了對細菌、病毒、真菌和寄生蟲發揮廣泛的抗菌活性，LL-37 具有許多促炎和抗炎及趨化特性，這些特性可能有助于自身免疫性疾病的發展。Kim HJ 等[26]研究證明，與健康對照組相比，LL-37 在SSc 成纖維細胞中的表達增強，并且LL-37 通過調節Bcl-2、caspase-3、COX-2 和ERK 途徑抑制硝普鈉（SNP）誘導的SSc 成纖維細胞凋亡。因此，LL-37可能通過抑制真皮成纖維細胞凋亡而在皮膚硬化中發揮作用，因此，建議LL-37 作為間質性肺病的一個可能的標記物。Takahashi T 等[27]通過免疫染色和定量RT-PCR 研究了患者和SSc 動物模型的血清LL-37 水平和LL-37 在病變皮膚中的表達，結果顯示在系統性硬化性皮膚病變中，LL-37 表達增加并與干擾素-α 表達相關，這可能反映了LL-37 依賴性干擾素-α 的誘導作用。

4 細胞漿來源的警報素在SSc 中的表達及功能

4.1 HSP-70 HSP-70 是熱休克70 kDa 蛋白，是熱休克蛋白家族中組重要的一員，被稱為主要熱休克蛋白，包括分子量為68、72、73、75、78 kDa 等的20多種蛋白。HSP70 家族蛋白分子量相近（等電點pH5.2～6.3），胰蛋白酶肽譜相似，在幾乎所有生物的應激細胞中常被高度誘導，具有保護機體和細胞的功能。Ogawa F 等[28]研究發現，HSP-70 在局限性皮膚和彌漫性皮膚SSc 患者中的均有表達，肺纖維化或指骨攣縮癥患者的HSP70 水平明顯高于無這些損傷的患者，且血清HSP70 水平與改良的Rodnan皮膚總厚度評分、腎血管阻力、血清單核細胞趨化蛋白-1、CRP 和血清8-異丙醇烷水平呈正相關。在其后的研究中，Ogawa F 等[29]研究再次證明，HSP70 在SSc 中的氧化還原相關作用，結果顯示在伴有肺纖維化和心臟受累的SSc 患者中抗甲硫氨酸亞砜還原酶a（MSRA）的自身抗體顯著升高，抗MSRA 抗體與腎血管損傷呈正相關，與肺功能檢測呈負相關?？筂SRA 抗體水平是相關的血清中8-異丙醇烷和熱休克蛋白70 呈陽性反應。Misunová M 等[30]研究分析了兩個可誘導的HSP70 基因，即HSPA1A 和HSPA1B 在各種系統性自身免疫性疾病患者中的表達調節，結果發現與健康對照組相比，SSc 和其他自身免疫性疾病患者HSPA1A 基因的表達顯著上調，且只有在SSc 患者中，HSPA1A 的增加被認為與細胞外HSP70 蛋白水平的增加有關。

4.2 S100 S100 是一個高酸性鈣結合蛋白家族，存在于許多身體器官中，它們在幾種鈣結合蛋白上有共同的EF-hand 基序。S100 家族被發現是亞類的延伸，S100A7 也被稱為“銀屑素”，是一種小的鈣結合蛋白在銀屑病皮膚中表達的11.4kda 的S100 蛋白家族，其表達上調，后來研究發現其在其他炎癥性皮膚病中也有升高，被證明是中性粒細胞和CD4 T 淋巴細胞的一種有效的趨化性炎癥蛋白[31]。S100A8/A9（以前稱為MRp8-14）在關節炎和其他自身免疫性疾病的發病機制中也有作用。Nikitorowicz-Buniak J等[32]在一些結締組織疾病患者的血清中發現血漿中S100A8/A9 水平升高，包括系統性硬化癥。彌漫性皮膚SSc（dcSSc）中血漿S100A8 水平升高，可能作為間質性肺疾?。↖LD）的生物標志物。在SSc 患者中，血漿中S100A9 的水平增加可能是由于S100A9 通過Toll 樣受體誘導成纖維細胞增殖和結締組織生長因子（CTGF/CCN2）的產生，促進了SSc 組織纖維化的發展?？傊?，上皮細胞在SSc 中的作用具有重要作用，而S100 是這一過程的關鍵介質。

5 總結

警報素及其受體在先天性和適應性免疫反應以啟動宿主對危險信號的防御中起著重要作用。越來越多的證據表明在許多炎癥和自身免疫性疾病中存在異常的警報素反應，因此，靶向針對警報素對纖維性疾病具有巨大的治療潛力，意義在于抑制血管病變、炎癥和纖維化。P5779 肽、抗HMGB1 單抗、白藜蘆醇和右美托咪定抑制HGMB-1/TLR4 介導的炎癥反應，在不同炎癥性疾病的實驗模型中取得了令人滿意的結果。IL-33 是另一個促纖維化警報素潛在的新治療靶點，用于治療SSc 患者的纖維化。IL-33抑制劑（CNTO-7160）目前正在哮喘和特應性皮炎的臨床試驗中進行檢查，因已經觀察到抗纖維化作用對肺的作用，因此它可能被用作SSc 患者纖維化的新療法。通過IL-1 家族細胞因子（如白細胞介素1 受體拮抗劑anakinra）抑制信號傳導已被用于不同的自身免疫性疾病，包括類風濕關節炎。然而，很少有研究探討SSc 的臨床益處。總之，臨床需要對警報素在SSc 中的作用進行更深入的研究，以擴大對先天性免疫反應在致殘性疾病發病機制中的作用的認識，同時也為新的治療策略提供基礎。