非編碼RNA在百草枯中毒機制中的研究進展

孟婷婷綜述 李鐵剛審校

百草枯(paraquat,PQ)，又名對草快、克蕪蹤，化學名稱為1，1-二甲基-4，4-聯吡啶陽離子鹽，是一種聯吡啶類除草劑。由于其價格低廉，使用方便，已在世界范圍內廣泛使用，同時也成為發展中國家常見的農藥中毒致死原因。據統計，百草枯中毒致死率高達50%～70%[1]。百草枯可通過消化道、呼吸道、皮膚吸收而致多器官損傷，但尤以肺損傷為主。一些學者認為百草枯與肺內二胺和腐胺、精胺、亞精胺等多胺的結構相似，從而導致肺競爭性地積累百草枯[2]。中毒者可出現致死性肺出血、水腫，經過搶救度過急性期的患者大多數也會發生不可逆性的肺纖維化、增生等改變；此外還可致肝、腎損害，同時累及循環、神經、血液、泌尿等系統[3]。由于沒有特效解毒藥，百草枯中毒預后很差。本文對近年來有關百草枯中毒的研究及長鏈非編碼RNA在百草枯治療中的進展進行綜述。

1 非編碼RNA定義

人類基因組研究計劃成果認為，人類30多億個堿基對的基因序列中2/3序列被反轉錄，而最終僅有不到2%核酸序列用于編碼蛋白，大部分基因不表達蛋白質，這一類基因被稱為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。過去非編碼RNA被認為是垃圾RNA，但隨著研究深入，非編碼RNA作為影響基因表達因素而逐漸被重視[4]。非編碼RNA通常指不編碼蛋白質的RNA，但這并不意味著這種RNA既不包含信息也不具有功能。隨著高通量測序技術的突飛猛進，非編碼RNA的研究也逐漸深入，這些RNA似乎包含一個隱藏的內部信號層。這些內部信號層控制著生理和發育中不同水平的基因表達，包括染色質結構、表觀遺傳記憶、轉錄、RNA剪接、編輯、翻譯和翻轉。人們意識到非編碼RNA可以通過其穩定的二級或三級結構發揮多種生物學功能。非編碼RNA 根據長度可劃分為3類：<50 nt，包括microRNA、siRNA、piRNA；50～500 nt，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA 等；>500 nt，包括長的mRNA-like非編碼RNA、長的不帶polyA 尾巴的非編碼RNA等。但目前的研究熱點是具有調節功能的RNA，主要是miRNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。許多非編碼RNA多聚腺苷化后大部分仍會保留在核內，少數會被運輸到胞質。胞內的miRNA和lncRNA分別與mRNA和miRNA的3’端非翻譯區的堿基序列互補結合，進而影響RNA的降解或者翻譯過程，導致靶細胞發生相應病理生理變化。

2 百草枯中毒機制

百草枯中毒機制尚未完全清楚，目前研究比較廣的主要有以下幾個學說：氧自由基產生學說、線粒體損傷學說、分子生物學說和酶失衡學說。這些學說都源于微粒體起源理論、線粒體起源理論[3]，即百草枯在含有肝微粒體和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成系統的孵育混合物生物轉化過程中形成了羥基自由基，而線粒體是百草枯自由基形成的場所和靶點。眾多實驗研究證實，百草枯所致的細胞損傷最初表現為線粒體腫脹，隨后出現明顯的細胞變性和細胞質水腫。自由基的強氧化性、氧化還原酶系的失衡損傷細胞的膜結構和功能、細胞內的能量、物質代謝系統障礙，最終導致細胞水腫、凋亡，加重組織炎性反應。而長鏈非編碼RNA在百草枯中毒機制中通過其競爭性的結合mRNA，減弱miRNA對細胞調節作用，間接調控mRNA，而發揮著增強或減弱線粒體的損傷和胞內氧自由基的產生。

3 百草枯中毒肺損傷機制

百草枯中毒的動物實驗和臨床病例分析均已證明百草枯主要積聚在肺部，即使治療后血液中的百草枯濃度降低，但肺內百草枯水平卻無任何變化[3]。該效應可用肺內多胺轉運系統解釋，該轉運系統在肺泡Ⅰ型、Ⅱ型細胞膜上大量表達。百草枯在肺內易聚集，不易消除的特點，使得肺成為百草枯對人體損害的首要靶器官。研究證實，上皮—間質轉化機制、炎性因子的介導和氧化應激在百草枯致肺損傷中發揮重要作用。

3.1 上皮—間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT) EMT指上皮細胞從形態學上到間質細胞的轉化，它賦予了細胞侵襲和遷移的能力。EMT被認為是腫瘤形成和器官纖維化形成中的重要步驟。Yamada等[5]證實EMT在百草枯致肺纖維化中也起著重要作用。肺纖維化中肌成纖維細胞主要由肺泡上皮細胞通過EMT而來，表現為上皮標志蛋白E-cadherin表達降低，而纖維化相關基因基質金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA水平升高[5-6]。除此之外，細胞因子在EMT形成過程中也扮演著重要角色。研究已經證實，轉化生長因子β(TGF-β)激活TGF-β/Smad信號通路[7-8]；缺氧誘導因子-1α(HIF1α)調 控 Snail和 β-catenin信號通路[9-10]；HIF1α調節 LOX/β-catenin的表達[11]；結締組織生長因子(CTGF)的表達均參與了EMT和早期肺纖維化的形成過程[12]。

3.2 炎性介質 參與和介導炎性反應的細胞因子稱為炎性介質。目前研究已經發現，炎性介質可參與腫瘤形成、血液病發展、器官纖維化過程。百草枯可激活中性粒細胞、巨噬細胞等分泌細胞因子，參與肺纖維化過程。研究已經證實，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)、白介素1β(IL-1β)和IL-6的表達水平，在百草枯所致的急性肺損傷中明顯升高[13]。

3.3 氧化應激 對百草枯中毒機制的研究發現，百草枯在被人體吸收進入血液循環后，經歷了氧化還原循環的交替還原和再氧化過程，并在氧化還原循環過程中起到催化作用，生成負氧離子，然后引發一個級聯反應，導致其他活性氧物種(ROS)的產生，主要是過氧化氫[14]。Adachid等[15]在2003年首次發現連續劑量的百草枯可致膽固醇過氧化和肺損傷。Chen等[16]研究顯示,百草枯處理過小鼠的肺髓過氧化物酶活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和4-羥基壬醛(4-hydroxyneonal)蛋白活性升高，這進一步證實了氧化應激損傷在百草枯致肺纖維化進程中發揮重要作用。

4 非編碼RNA與百草枯中毒機制

4.1 MicroRNA (miRNA) 與百草枯中毒 miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠與mRNA 的3’UTR(3’-untranslated region)互補結合，抑制mRNA的翻譯或降低mRNA的穩定，從而調節mRNA的表達[17]，間接調控多種生物學行為，如增生、分化和凋亡。miRNA除可在腫瘤發生中發揮重要作用外，近來研究發現，miRNA在百草枯中毒中也扮演著重要角色。

黃敏等[18]用微陣列測序分析百草枯誘導腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)的miRNA測序譜顯示，隨著百草枯濃度的增加,miR-Let-7e表達水平持續下降,而miR-34a表達水平持續上升,bcl-2蛋白表達水平降低，且與miR-34a的表達量呈劑量—效應關系；這說明miRNAs的異常表達參與了PQ致PC12細胞損傷過程，同時PQ可能通過上調miR-34a表達增加bcl-2蛋白表達,進而誘導PC12細胞凋亡。朱勇[19]在百草枯致肺纖維化模型中發現HIF-1α及其靶基因micro RNA-210(miR-210)存在相互調控關系，并在致肺纖維化中對EMT有重要作用。PQ中毒后，大鼠肺組織即有HIF-1α表達顯著升高；上皮標志物ZO-1和E-cadherin表達減少,間質標志物α-SMA明顯增多,即發生了EMT；miR-210表達明顯增加。在細胞內沉默HIF-1α后，Snail和β-catenin表達明顯減少,PQ中毒誘導的EMT程度減輕；miR-210表達明顯下降。而體外過表達miR-210后,間質標志物α-SMA進一步增多,上皮標志物ZO-1和E-cadherin進一步減少,EMT程度加重,HIF-1α表達增多；抑制miR-210后,明顯減輕PQ中毒誘導的EMT,HIF-1α顯著減少。以上的實驗結果提示，HIF-1α和miR-210之間存在正反饋調控,細胞內HIF-1α增多,一方面調節EMT,另一方面進一步促進miR-210表達,形成惡性循環,不斷促進PQ誘導的EMT和肺纖維化發生發展；HIF-1α可能是治療PQ中毒致肺纖維化的一個潛在靶點。蔡志鵬[20]用百草枯誘導小鼠神經母細胞，探討miR-380-3p在百草枯致神經細胞損害中的作用及其與Nrf2的關系。用qRT-PCR觀察細胞mRNA表達水平，顯示百草枯可下調神經細胞內miR-380-3p的表達水平，而轉錄因子Nrf2的激活可以上調神經細胞內miR-380-3p表達水平，miR-380-3p的過表達可導致神經細胞(Neuro-2a)增殖活性下降、凋亡率升高及周期阻滯。詹燕婷[21]通過實驗觀察miR-17-5p功能獲得與功能失去在PQ致小鼠神經母細胞瘤細胞(Neuro-2a)增殖、凋亡、細胞周期改變中的影響，PQ可誘導神經細胞miR-17-5p表達下調和DNA甲基化水平升高；這說明miR-17-5p參與PQ誘導的神經細胞凋亡、細胞周期的改變。

因此，miRNA可以作為一種新的研究標志物，降低或抑制miRNA在體內的表達，從而引起百草枯誘導的細胞凋亡、細胞周期的改變，為百草枯中毒、治療、預后提供一個新的思路。

4.2 lncRNA與百草枯中毒 lncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，過去人們認為lncRNA是轉錄“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，不具有生物學功能[22]。近年來隨著對lncRNA的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程；同時也在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用[23-25]。在Salmena等[26]提出ceRNA概念后，科研人員發現lncRNA因miRNA含有某個或多個反應元件(microRNA response elements，MREs)，可與mRNAs競爭性結合miRNAs，從而調節mRNA的表達，參與肺纖維化、腫瘤、百草枯中毒等疾病的發生發展。近年來，有不少學者研究lncRNA作為調控生命活動的重要大分子在百草枯中毒中所扮演的重要角色，從而為百草枯中毒治療、防治提供新的靶點。

楊虹雨等[27]研究了A07-17-0016 lncRNA NR_030777 在百草枯致神經細胞損害中對Zfp326/Cpne5 表達的調控及對細胞增殖凋亡的影響，PQ 處理可引起小鼠神經母細胞瘤(Neuro-2a, N2a)增殖活力下降，細胞凋亡增加，NR_030777 LncRNANR_030777表達升高，Zfp326 mRNA 表達降低，Cpne5 mRNA表達升高；敲低NR_030777，會使PQ誘導的N2a細胞增殖活力、Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表達量受到抑制；而過表達 NR_030777，會使PQ誘導的Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表達量產生一定的協同作用；同時能夠拮抗 PQ 對細胞的毒性。此研究說明，lncRNA能夠調控mRNA分子的表達，并能夠抵抗百草枯誘導的神經細胞損害作用。

張銀銀等[28]研究lncRNA-AK039862在PQ誘導的小鼠帕金森病模型中發現，lncRNA-AK039862在PQ抑制神經小膠質細胞和/或多巴胺能細胞增殖活力中起到協同作用；可在PQ處理的神經小膠質細胞中正向調控Foxa1基因轉錄過程,并促進Pafah1b1轉錄、翻譯過程。陳俊杰[29]通過構建百草枯誘導的小鼠肺纖維化模型，抽取小鼠肺組織，行lncRNA芯片分析，發現多種lncRNA參與小鼠肺纖維化過程，選取其中差異表達的lncRNAuc.77及2700086A05Rik轉染至人肺腺癌細胞(A549)，發現其靶基因ZEB2及HOXA3表達明顯變化,并引起細胞形態改變,促進纖維化相關基因表達變化。以上的研究說明，lncRNA可以發揮其調節功能，從而影響細胞的生命活力。

5 小結與展望

非編碼RNA雖然不能編碼蛋白質，但能夠與具有同源性的DNA和RNA結合，從而調節信息表達；也可以通過折疊其二級結構，參與轉錄前和轉錄后調控。綜上所述，非編碼RNA在百草枯中毒機制的研究中，其主要通過信號通路、細胞因子、蛋白分子的參與，或競爭性地結合miRNA調控EMT進程，調控相關凋亡蛋白分子等發揮影響。非編碼RNA 在百草枯中毒機制研究取得的進展，為百草枯中毒治療提供了非常有價值的生物學標志物和治療靶點。但目前，針對非編碼RNA在百草枯中毒機制的研究尚處于起始階段，很多問題尚未解決，如非編碼RNA如何在轉錄前、轉錄后調控相關信號通路、相關蛋白分子，又有哪些非編碼RNA分子介導了炎性反應—免疫反應調控。這些問題引導臨床繼續深入探究非編碼RNA在百草枯中毒中所起的作用。