肌球蛋白輕鏈激酶介導的肌球蛋白調節輕鏈磷酸化研究

高 文，李 科，李雪萍，李 亞，宋 梅

（1.西安醫學院臨床醫學院，陜西 西安 710021；2.西安醫學院第一附屬醫院，陜西 西安 710003）

肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是一種專門依賴Ca2+/CaM（鈣調素）的蛋白激酶，廣泛存在于骨骼肌、平滑肌、心肌以及哺乳動物非肌肉細胞中，通過催化肌球蛋白調節輕鏈（regulatory light chain of myosin，RLC）N 末端絲氨酸殘基的磷酸化，可增強肌動蛋白激活的肌球蛋白ATP 酶活性，從而促進肌球蛋白和肌動蛋白之間的相互作用[1]。MLCK 在選擇蛋白質底物方面存在顯著特異性，RLC 是其唯一已知的生理底物。Ca2+/CaM 依賴的MLCK 磷酸化RLC 在細胞功能中起著不同作用[2，3]，例如平滑肌收縮的起始、骨骼肌和心肌收縮力的增強、血小板和內皮細胞的聚集收縮、成纖維細胞的收縮和分泌以及軸突生長錐的運動。本文將對MLCK 分型、結構及RLC 磷酸化在不同肌肉組織中的生物學作用進行闡述，旨在為相關疾病的臨床診療新技術提供思路及理論依據。

1 MLCK 的分型

MLCK 是由4 種不同的激酶MLCK1，MLCK2，MLCK3 和MLCK4 組成，分別由4 種不同的基因MYLK1，MYLK2，MYLK3 和MYLK4 編碼[4，5]。根據其肌肉類型的特異性表達和活動，MLCK1 被稱為平滑肌MLCK（smooth muscle MLCK，smMLCK），MLCK2被稱為骨骼肌MLCK（skeletal muscle MLCK，skMLCK），MLCK3 被稱為心肌MLCK（cardiac muscle MLCK，cMLCK），MLCK4 是最近才被發現的，基于其在心肌細胞中的選擇性蛋白表達，可能是另一種心肌MLCK[4]。每塊肌肉中存在著特定的MLCK，這種差異表明每塊肌肉在體內的特殊作用，并有助于以不同的方式在每一個組織中進行不同的能量活動。

2 MLCK 的結構

與skMLCK 和cMLCK 相比，smMLCK 的基因結構較為復雜，它的多種蛋白質產物在所有組織中幾乎均有表達，包括骨骼肌和心肌[6]。MYLK1 基因以細胞特異性的方式表達3 個轉錄本，這是由交替啟動子決定的。在人類基因組中，MYLK1 基因編碼非肌肉亞型、平滑肌亞型以及由不同起始位點編碼的終止蛋白Telokin（也稱為激酶相關蛋白或KRP）亞型。由于非肌肉亞型結構中存在N-末端氨基酸的延伸，因此非肌肉亞型是一種高分子量亞型，被稱為長型MLCK，平滑肌亞型是低分子量亞型被稱為短型MLCK，其在平滑肌和非肌肉細胞中的表達存在差異性。短型MLCK 具有一個催化核心，是一個包含自抑制和鈣調素結合序列的調控片段，還包含3 個免疫球蛋白結構模塊（Ig）、纖連蛋白結構模塊（Fn）、富含PEVK 重復區域和三個N-末端重復的DFRXXL 肌動蛋白結合序列[7]。與短型MLCK 相比，長型MLCK 是同一基因通過其他啟動子編碼的蛋白產物，其N-末端含有額外的結構模塊，在內皮細胞、上皮細胞以及其他非肌肉細胞中的含量較豐富，且在細胞的遷移過程中起著重要作用[8]。Telokin 蛋白是由位于MLCK 基因內含子中的另一啟動子轉錄的一種17 KDa 的平滑肌特異性蛋白，由于缺乏激酶結構域，其催化活性較低。Telokin 結構與MLCK 和鈣調蛋白結構域下游的C-末端結構相同，該結構可促進酶與未磷酸化的RLC 或肌球蛋白的結合，從而增強MLCK 的收縮活性[7]。它僅僅在平滑肌組織和細胞中有表達，例如腸道、尿路上皮、生殖道平滑肌中含量最豐富[9]。

在骨骼肌中，skMLCK 選擇性表達一種獨特的MLCK，在快速抽搐纖維中含量最高[4]。有研究報道[10]，skMLCK 也存在于心臟，但其含量太低，無法維持RLC 的基本磷酸化。skMLCK 具有與smMLCK 相似的催化核心和調控片段，C 末端含有一個自抑制序列，該序列包含一個鈣調素結合序列，并與酶的活性位點直接相互作用以抑制激活[11]。盡管這兩種酶都是RLC 作為唯一生理底物的特異性蛋白激酶，但是二者在底物識別決定因子方面的催化特性存在差異。

cMLCK 基因在心房和心室肌細胞中都有特異性表達，由保守的激酶結構域組成，該區域包括一個C-末端的ATP 酶結合位點，其氨基酸末端具有獨特性，與其它已知蛋白無明顯同源性[12]。有研究發現[13]，cMLCK 在人類心力衰竭過程中可被同源盒蛋白Nkx2-5 高度調控。

最近發現的MLCK4 也是在心肌中有表達，催化的結構域序列與其它MLCK 相似，但缺乏一個自抑制調控片段[14]。其晶體結構以活性構象顯示催化結構域，一個短的C 端“假調節螺旋”（PRH）代替了一個完整的自我調節片段，由于缺少連接區，不能抑制催化作用[5]。通過比較MLCK4 的晶體結構與其它MLCK 的結構序列，可以推測MLCK4 可能具有Ca2+/CaM 獨立的激酶活性。

3 RLC 的磷酸化及其生物學作用

3.1 RLC 磷酸化在平滑肌中的作用 所有的平滑肌細胞中都含有肌球蛋白，肌球蛋白分子是由兩條重鏈和兩對肌球蛋白輕鏈組成的六聚體結構[15]。重鏈運動域可逆地與肌動蛋白絲結合，通過水解ATP，從而將化學能轉化為機械能。Ca2+/CaM 依賴的MLCK 激活平滑肌與非肌肉細胞肌球蛋白，并磷酸化RLC，以促進肌球蛋白與肌動蛋白之間的相互作用[16]。在大多數細胞類型中，RLC 的磷酸化對于調節肌動球蛋白的細胞骨架功能具有重要意義，例如局灶性黏連和應力纖維的形成、離子交換、胞質分裂、軸突生長錐的推進、細胞擴散、內皮和上皮屏障的形成、細胞的遷移等[17，18]。在平滑肌中，RLC 的磷酸化也被認為是參與肌肉收縮起始的關鍵步驟[2]。長型MLCK 和短型MLCK 在細胞功能上有著顯著差異，綠色熒光蛋白標記的長型MLCK 的熒光成像顯示，該亞型定位于有絲分裂HeLa 細胞的卵裂溝中，而綠色熒光蛋白標記的短型MLCK 則廣泛存在于細胞質中。

由于其專一的性質，MLCK 在調節非肌肉細胞的多種功能和平滑肌收縮活動中的重要性顯而易見，MLCK 表達的改變將影響細胞的生理功能，例如在心血管系統中，MLCK 表達的改變將影響內皮細胞的屏障功能和血管平滑肌細胞的張力，從而影響血壓[19]。相關研究也表明，在血管損傷[20]，腸道炎癥[21]，氣道超敏反應[22，23]等病理條件下，MLCK 的表達也隨之發生變化。

3.2 RLC 磷酸化對快速骨骼肌收縮的調節作用 骨骼肌肌節是由肌動蛋白細絲和肌球蛋白粗絲規律排列構成的。來自神經肌肉接頭處的動作電位穿過肌膜，并進入T 管，觸發肌漿網釋放Ca2+，細胞內升高的Ca2+通過與肌節細絲中的肌鈣蛋白結合，引起骨骼肌的收縮，從而允許粗絲中的肌球蛋白跨橋與細絲中的肌鈣蛋白結合[24]。釋放到肌節中的Ca2+也能夠調節skMLCK 的活性，并作為一種生化記憶，在長時間或重復活動中增強肌肉的收縮力量。近年來關于動物快速抽搐骨骼肌的研究表明，skMLCK 介導的RLC 磷酸化與強直性肌肉刺激后等長抽搐力的振幅增加存在時間相關性[25-27]。由于肌肉疲勞，使得肌肉力量出現可逆性下降，這是肌肉持續活動的必然結果。然而，快速抽搐骨骼肌的一個顯著特性是在疲勞期間抽搐力增強與強直力下降共存[28]。由于疲勞不會干擾RLC 磷酸化的能力，因此在這種情況下，此機制似乎可以增強低頻肌肉的力量，以幫助維持肌肉功能。

目前對于skMLCK 和RLC 磷酸化在人骨骼肌中的作用的認識有限。人類骨骼肌的激活后增強（postactivation potentation，PAP）最近受到廣泛關注，因其可能影響人類在力量和耐力運動中的表現[28]。PAP 是由強烈的自發收縮引起的，在隨后的抽搐收縮過程中，這種自發收縮會增加峰值力和力的發展速度。PAP 的潛在機制是RLC 磷酸化和運動單位的增加。因此，在隨后的爆發性肌肉活動中比如跳躍、短跑等，可以通過調節收縮來增強力量，從而誘發PAP[3]。

3.3 RLC 磷酸化在心臟生理病理中的作用 心臟是由心肌細胞組成的無意識橫紋肌，通過協調心肌收縮和舒張的連續循環，將血液從心房和心室泵入肺部及全身血管。在持續跳動的心臟中，肌肉在很長一段時間內不會因肌絲收縮蛋白Ca2+激活或失活的周期性增加和減少而放松。心臟與調節其功能的信號傳導模塊之間有著復雜的聯系。在心肌細胞的收縮裝置中，主要的驅動因素是肌球蛋白分子的ATP 酶活性，而cMLCK 通過磷酸化心肌RLC 來激活或調節肌球蛋白的ATP 酶活性。Sevrieva 等[29]通過建立動物模型研究發現，無論是cMLCK 的消融還是RLC 的磷酸化都可導致心肌收縮力障礙和心肌病理性肥厚。心力衰竭是由多因素引起的復雜疾病，收縮反應中的肌原纖維蛋白磷酸化的改變在心力衰竭患者心泵功能下降中起著重要作用。在人類心力衰竭和心衰的動物模型中發現，cMLCK 表達和RLC的磷酸化程度都降低[30]。cMLCK 的過度表達增加了心肌收縮力，cMLCK 的下調則降低了心肌收縮力。這些研究充分表明RLC 磷酸化是心臟功能的決定因素，RLC 磷酸化的水平降低直接影響心臟功能。cMLCK 的過度表達增加了心肌收縮力，cMLCK 的下調則降低了心肌收縮力，cMLCK 和RLC 的磷酸化在維持正常心肌肌節結構中發揮著重要作用。

家族性肥厚性心肌病（familial hypertrophic cardiomyopathy，FHC）是一種常染色體顯性遺傳疾病，由包括心室RLC 在內的所有主要肌節蛋白的突變引起，從而導致肌原纖維紊亂和心室肌增厚，并損害心臟的收縮功能。研究表明[31]，RLC 基因突變的小鼠心室RLC 磷酸化水平的降低與FHC 存在相關性。還有研究表明人心肌RLC 中谷氨酸-22 突變為賴氨酸也與肥厚型心肌病有關，這種突變抑制了磷酸化和Ca2+與RLC 的結合，此外，還增加了肌力發育和肌原纖維ATP 酶活性的Ca2+敏感性[32]。

總之，導致激酶活性喪失和RLC 磷酸化降低的cMLCK 基因突變將會導致肌節功能障礙和心力衰竭。對cMLCK 及RLC 磷酸化重要性的認識能夠為發現其在人類心臟病理生理中的作用提供新的臨床靶點。

4 總結

近年來，MLCK 備受關注，這突出了酶在生物醫學中的廣泛應用，本文綜述了MLCK 的結構以及RLC 磷酸化在不同肌肉組織中的生物功能，體現了RLC 磷酸化對健康和疾病中的肌肉活動有重要影響，從而為相關肌肉疾病的臨床研究提供新的思路，并可能成為未來的治療靶點。