胰腺癌細胞失巢凋亡相關抑制性分子研究進展

趙馨旭 黃林生 劉佳玲 余惠凡 李飛

1 湖北醫藥學院藥學院，十堰 442000；2十堰市太和醫院肝膽胰外科，十堰 442000

【提要】 失巢凋亡是細胞與細胞外基質或其他細胞脫離接觸而誘發的程序性凋亡，有利于機體發育及組織自身平衡，對惡性腫瘤細胞轉移及存活有重要作用。腫瘤細胞失巢凋亡抵抗在胰腺癌浸潤轉移過程中發揮重要作用，多種抑制胰腺癌細胞失巢調亡的分子通過干預腫瘤細胞失巢調亡而影響胰腺癌進展。

失巢凋亡(anoikis)是細胞與細胞外基質或其他細胞脫離接觸而誘發的程序性凋亡[1]。正常生理狀態下，細胞與細胞外基質失黏附時會引發失巢凋亡；病理條件下，具有失巢凋亡抗性的腫瘤細胞離開原位后可經淋巴或血液循環定位到遠處新組織或淋巴結繼續發展，即發生失巢凋亡抵抗，此過程是腫瘤擴散、轉移與侵襲的前提[2]。腫瘤細胞失巢凋亡抵抗在胰腺癌浸潤轉移過程中發揮重要作用[3]，本文就抑制胰腺癌細胞失巢凋亡的相關分子及其在胰腺癌進展中的作用進行綜述。

一、Bcl-2轉錄抑制因子1(Bcl-2 inhibitor of transcription 1，Bit1)

Bit1是唯一只受整合素負性調節的細胞死亡誘導因子，可通過下調Bcl-2表達發揮非caspase依賴型促凋亡功能[4]。研究表明，Bit1在胰腺癌組織中低表達且表達水平與胰腺癌神經浸潤程度及血清癌胚抗原水平呈負相關[5]。已有的研究表明，當細胞與細胞外基質黏附時，Bitl可通過維持Integrin整合素信號通路活性狀態，激活其下游PI3K/AKT信號通路，并磷酸化NF-kB，促使核內Bcl-2表達升高，發揮抑制細胞凋亡的作用。而細胞與細胞外基質失黏附時，Integrin整合素信號通路活性受到抑制，線粒體膜的通透性發生改變，Bit1蛋白從線粒體內膜向外膜遷移并發生磷酸化，從而促進細胞凋亡[5]。下調人胰腺癌PANC1細胞內Bit1表達水平可增強懸浮培養下PANC1細胞失巢凋亡能力，從而發揮促凋亡作用。與之相反，過表達的人胰腺癌MiaPaCa2細胞內Bit1表達水平可促進懸浮培養下MiaPaCa2細胞的凋亡，原因可能與胞質中的Bit1蛋白通過自身磷酸化與AES結合形成轉錄共調解復合物促進腫瘤細胞的凋亡有關。而貼壁培養的MiaPaCa-2細胞凋亡受到抑制，其可能通過激活Bcl-2的表達抑制細胞凋亡[6]。

二、局灶性黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)

FAK是以激酶依賴方式發揮作用的一種細胞質功能性蛋白[7]，與細胞遷移[8]、存活[9]、增殖[10]及黏附[11]密切相關。研究表明，FAK可增加細胞基質面積及局部黏附，抑制失巢凋亡。通過檢測poly HEMA誘導的胰腺癌細胞失巢凋亡后各細胞系的凋亡能力表明，高表達FAK的PANC1細胞抗失巢凋亡能力更強，而低表達FAK的人胰腺癌細胞Capan2失巢凋亡敏感性明顯高于對照組細胞系。沉默FAK基因可促進胰腺癌細胞失巢凋亡并逆轉MiaAR細胞(MiaPaCa2衍生的穩定抗失巢凋亡亞系)的失巢凋亡抵抗。錨定依賴性培養下，抑制FAK可促進MiaPaCa2及MiaAR細胞的caspase活化。此外，在腫瘤異種移植(patient-derived tumor xenograft， PDX)的裸鼠胰腺內注射1×106個正常MiaPaCa2和MiaAR細胞及低表達FAK的MiaPaCa2和MiaAR細胞，結果表明FAK基因沉默可抑制肝轉移[12]。

三、基質蛋白Del-1(developmental endothelial locus-1， Del-1)

Del-1是一種細胞外基質蛋白，因含3個重復的表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)樣結構域及2個盤狀結構I(discoidin-I)樣結構域，又被稱為EDIL3(epidermal growth factor-like repeats and discoidin I-like domains 3)。Del-1可通過誘導血管形成促進腫瘤生長，活化細胞因子或與腫瘤細胞表面特定受體結合，在腫瘤發生及發展中發揮重要作用[13-14]。研究表明，Del-1在胰腺癌中高表達且其表達水平與腫瘤神經浸潤呈正相關。Del-1可抑制胰腺癌細胞PANC1及Aspc-1失巢凋亡，其機制可能是通過改變凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達進而促進腫瘤遠處轉移[15]。EDIL3在PDAC中高表達，可抑制胰腺癌細胞SW1990和BxPC3失巢凋亡，并促進非錨定依賴性腫瘤的生長。Jiang等[16]發現，給裸鼠背部皮下注射3×106個SW1990細胞，3周后顯示EDIL3對PDAC腫瘤生長具有促進作用。此外，沉默EDIL3可顯著促進caspase3及caspase7活性，其可通過改變Bcl-2家族蛋白表達發揮抗凋亡作用。

四、Eph受體酪氨酸激酶A2(phrintype-A receptor 2， EphA2)

促紅細胞生成素產生肝細胞受體(erythropoietin producing hepatocellular receptor，Eph)及其配體ephrin[17]是受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase， RPTKs)家族主要分支，EphA2作為促新生血管形成蛋白，可參與調節腫瘤血管生成[18-19]及腫瘤營養供應，在腫瘤發生、發展中起重要的作用[20-21]。研究表明，過表達EphA2可增強Capan2細胞的侵襲能力及失巢凋亡抗性，caspase3活性也隨之增加。此外，降低MiaPaCa2細胞中EphA2的表達水平，可抑制FAK磷酸化，給予裸鼠皮下注射MiaPaCa2細胞可抑制PDX模型中腫瘤生長及轉移[22]。

五、癌胚抗原相關黏附分子6(carcinoembryonic antigen related adhesion molecules 6， CEACAM6)

CEACAM6屬于免疫球蛋白超家族，可通過糖基磷脂酰肌醇錨在細胞膜表面[23-24]。研究表明，CEACAM6基因沉默可降低PANC1、Capan2、MiaPaCa2及MiaAR細胞的失巢凋亡抗性。沉默CEACAM6可增強caspase介導的MiaPaCa2及MiaAR細胞的失巢凋亡敏感性，這一效應可被caspase抑制劑Z-Val-Ala-Asp-氟甲基酮(z-VAD-fmk)消除，其機制可能與下調CEACAM6后Akt活性下降及caspase8、caspase3活性升高相關[25]。人胰腺癌細胞BxPC3中CEACAM6與小凹蛋白1(caveolin-1， CAV1)交聯可增強c-Src活性，進而磷酸化FAK，從而誘導細胞失巢凋亡抵抗，提高BxPC3細胞的侵襲能力[26]。

六、神經生長因子(nerve growth factor， NGF)

NGF是從其前體pro NGF中分離出的神經系統生物活性分子，對神經元再生、發育及分化起調節作用[27]。近期研究表明，下調PANC1和Aspc-1細胞中pro NGF表達水平可抑制PANC1和BxPC3細胞增殖及侵襲能力，促進細胞失巢凋亡，其機制可能是通過下調自噬相關蛋白Beclin-1(酵母ATG6同源物)及自噬相關蛋白5(autophagy-related protein 5， ATG5)的表達，上調泛素結合蛋白p62的表達水平，從而促進胰腺癌細胞失巢凋亡[28]。

七、對氧磷酶 (paraoxonase， PON)

PON2基因家族包括PON1、PON2及PON3，三者具有高度同源性[29]。其中PON2在細胞內發揮抗氧化作用，可促進惡性腫瘤生長及轉移[30-31]。研究表明，PON2在胰腺癌中過表達，可通過刺激葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)介導的葡萄糖轉運阻止AMPK介導的失巢凋亡，從而促進PDAC轉移。給予caspase抑制劑z-VAD-fmk可抑制下調PON2表達水平后誘導的PANC1和Aspc-1細胞的失巢凋亡。能荷表示細胞所處能量狀態，對細胞代謝有重要調控作用。高能荷時ATP生成過程被抑制，而利用過程被激發；當能荷值低時，其效應相反。PON2與葡萄糖代謝相關酶GLUT1以及己糖激酶(hexokinase 2， HK2)基因敲除表型相似，下調PON2表達水平可顯著降低ATP/ADP及ADP/AMP，繼而導致腫瘤抑制因子叉頭蛋白O3A(forkhead box O3， FoxO3A)及其下游促凋亡靶基因p53上調凋亡調制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis， PUMA)的激活，從而誘導腫瘤細胞失巢凋亡，繼而抑制PDAC的生長及轉移[32]。

八、APOBEC3G(A3G)

APOBEC3是近年發現的具有脫氨基作用的一類胞苷脫氨酶，A3G為其家族成員之一，是具有抗病毒能力的病毒誘導蛋白，有廣譜抗病毒功能，可參與病毒的防御應答，促使病毒DNA發生超突變[33-35]。A3G在腫瘤的進展過程中也發揮重要作用，可通過抑制miR-29介導的基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase， MMP2)促進結直腸癌肝轉移[36]。A3G在胰腺癌中高表達，過表達的A3G通過抑制PTEN活性激活Akt通路，參與失巢凋亡抵抗，從而抑制BxPC3細胞失巢凋亡，并促進早期腫瘤形成。給予裸鼠側腹皮下注射不同數量穩定表達A3G的BxPC3細胞(1×105、5×105、1×106、5×106)，4周后移植瘤生長情況表明，過表達A3G可抑制裸鼠致瘤實驗后期腫瘤生長，其可能通過影響卷曲蛋白(frizzled， FZD)表達繼而參與調控Wnt通路，從而抑制腫瘤生長[37]。

九、GRHL2

果蠅粒狀頭樣(grainyhead like， GRHL)家族包括GRHL1(grainyhead-like 1，又稱mammalian granyhead， MGR或LBP-32)、GRHL2(grainyhead-like 2,又稱brother of mammalian grainyhead， BOM)和GRHL3(grainyhead-like 3，又稱sister of mammalian grainyhead， SOM，或粒狀頭樣上皮反式激活因子)，研究表明GRHL1和GRHL3的表達與皮膚鱗狀細胞癌的發生呈正相關，GRHL2不僅調控表皮細胞分化，同時還可促進或抑制多種腫瘤細胞的增殖[38-39]。GRHL2在肝轉移性PDAC細胞CFPAC-1中表達高于正常胰腺導管上皮細胞HPDE，其表達水平與E-cadherin及CD133呈正相關。降低CFPAC-1的GRHL2表達水平可促進細胞失巢凋亡，其可能通過誘導上皮細胞間質轉化從而促進癌細胞遷移及侵襲能力。此外，GRHL2可調節PDAC的上皮可塑性及干細胞樣特性，促進CFPAC-1細胞自我更新，對腫瘤發生和發展至關重要[40]。

十、miR-137

微小RNAs(microRNAs， miRNAs)是長度19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，主要參與靶基因的轉錄后調控[41]。miRNA的異常表達與腫瘤的發生和進展密切相關，近期miRNA與胰腺癌失巢凋亡抵抗亦有相關報道。miR-137是一種腫瘤抑制因子，在胰腺癌中低表達[42]。上調miR-137表達水平后，胰腺癌細胞MiaPaCa2及PANC1侵襲遷移能力明顯減弱[43]。此外，上調胰腺癌細胞PANC1及Aspc-1中miR-137表達水平可抑制細胞增殖能力并顯著提高細胞凋亡能力[44]。研究表明，過表達的miR-137可抑制胰腺癌細胞PANC1及Aspc-1的失巢凋亡，其可能通過抑制樁蛋白(paxillin， PXN)活性而激活Akt通路，參與失巢凋亡抵抗[45]。

失巢凋亡對維護組織結構完整和內環境穩定具有重要意義。正常上皮細胞對失巢凋亡敏感度高，而腫瘤細胞可通過自分泌或旁分泌機制抑制失巢凋亡，通過促進腫瘤細胞浸潤、刺激血管新生而生存。腫瘤細胞尤其是易發生遠處轉移的惡性腫瘤細胞都具有極強的抗失巢凋亡能力，該能力的獲取被認為是惡性腫瘤細胞進行侵襲、轉移的先決條件。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突