新型冠狀病毒肺炎的流行病學特征及實驗室檢測

孫 澤，寇 喆，王啟龍，周開心，李怡湘，廉 婷

（1.西安醫學院臨床醫學院/陜西省呼吸病預防及診治工程研究中心，陜西 西安 710021；2.西安醫學院衛生管理學院，陜西 西安 710061）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起，具有高度傳染性，重癥患者死亡高[1]。目前掌握該病的流行病學特征及實驗室檢測方法，盡早診斷，及時隔離及治療是提高患者治愈率及防治疫情進一步擴散的關鍵。本文對COVID-19 的流行病學特征和實驗室檢測技術的最新進展進行綜述，以期為其早期診斷和有效防控提供參考。

1 SARS-CoV-2 的病原學

冠狀病毒是一類有包膜的單鏈RNA 病毒，呈球形或橢圓形，包膜上有刺突蛋白，電鏡下呈“皇冠狀”。SARS-CoV-2 是第7 種已確定可感染人的冠狀病毒，其中4 種感染人后，主要引起上呼吸道感染，癥狀類似普通感冒；還有3 種是有高致命性的β 屬冠狀病毒，分別是嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、中東呼吸綜合征（MERS）和COVID-19，主要攻擊下呼吸道系統，導致病毒性肺炎綜合征。

SARS-CoV-2 有4 種主要結構蛋白，即刺突糖蛋白（S）、小包膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。S 蛋白是疫苗開發的關鍵靶標，介導病毒與人體細胞表面的血管緊張素轉換酶2（ACE2）的結合，決定了病毒的宿主特異性和傳染性。N 蛋白常作為COVID-19 早期診斷工具靶標，有研究取7 個研究中心的239 例疑似COVID-19 患者的鼻咽拭子和另一個研究中心20 例患者的尿樣，用免疫熒光層析試紙條檢測N 蛋白，用鼻咽拭子核酸檢測作為參考標準，結果完全匹配，最早的參與者在發燒3 天后就可以被識別[2]。

2 COVID-19 的流行病學特征

2.1 傳染源COVID-19 的傳染源 主要是SARSCoV-2 感染的患者。南京市疾病預防控制中心報道了24 例無癥狀COVID-19 病例的臨床表現和流行病學特征，提示無癥狀患者具有潛在傳播能力[3]。中國疾病預防控制中心對2019 年12 月31 日～2020年2 月11 日收錄的72314 個病例中無癥狀感染者共889 例，占比1.2%[4]。目前，無癥狀感染者成為現階段我國的重要監測目標之一。2020 年4 月1 日國家衛健委首次將無癥狀感染者病例的數據列入每日通報，截至4 月9 日24 時，接受醫學觀察的無癥狀感染者為1104 例。有研究[5]，通過基因測序比對，SARS-CoV-2 與蝙蝠相關冠狀病毒同源性約為88%，而SARS-CoV-2 的進化鄰居和外類群也都在各類蝙蝠中有發現，推測蝙蝠可能是其自然宿主。此外，SARS-CoV-2 和多種穿山甲、龜類冠狀病毒譜系具有高度相似性，提示穿山甲[6]、龜[7]可能是其潛在中間宿主。

2.2 傳播途徑 SARS-CoV-2 具有較強的人際傳播能力，主要通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，特定空間內存在氣溶膠傳播的風險。隨著病例的不斷加入，其他傳播途徑也引起了研究人員的注意。有研究顯示[8]，在患者糞便樣本檢測出SARS-CoV-2，雖其消化道（糞-口）傳播途徑有待證實，但需做好排污措施，以杜絕可能經下水道傳播的風險。有報道顯示，在1 例確診COVID-19 孕婦分娩，新生兒30 小時后行咽拭子SARS-CoV-2 核酸檢測呈陽性[4]，提示可能有母嬰傳播的風險。而2 月12 日，《Lancet》發布的母嬰垂直傳播研究最新進展顯示，尚無證據表明妊娠晚期發生COVID-19 會引起宮內感染[9]。2020年4 月8 日，中國農業科學院和中國疾病預防控制中心共同研究發現SARS-CoV-2 在狗、豬、雞和鴨身上復制能力較差，但能在雪貂和貓身上有效復制，除此之外，該研究還發現貓與貓之間可以通過呼吸道飛沫進行傳播；該研究為SARS-CoV-2 和COVID-19 的控制以及動物管理模式提供了重要的見解[10]，但病毒是否會在人與寵物間跨物種傳播仍需更深入的研究。

2.3 潛伏期和感染期 COVID-19 潛伏期1～14 天，以3～7 天居多[1]。鐘南山院士團隊2020 年2 月29 日發表論文，對全國552 家醫院中抽取的1099 例COVID-19 確診病例進行分析，得出潛伏期中位數為4 天，極個別病例的潛伏期可達24 天[11]。值得注意的是，COVID-19 在潛伏期仍具傳染性，因此密切接觸者一般需14 天的隔離觀察。

2.4 易感人群 人群普遍易感[1]。SARS-CoV-2 的感染與接觸病毒的載量有關，減少接觸或暴露可有效降低感染。中科院武漢病毒研究所石正麗團隊證明血管緊張素轉換酶2（ACE2）是SARS-CoV-2 進入宿主細胞的主要受體，可介導病毒入侵人體[12]。有研究通過八例正常人的單細胞測序結果進行比對，發現ACE2 表達與年齡和吸煙情況無相關性；ACE2在男性個體（2 例）中的表達水平總體比女性（6 例）高3 倍以上，這與目前流行病學觀察到的COVID-19 男性患者為女性數量的三倍大致吻合[13]。了解疾病的易感人群，對于疫情的防治至關重要，期待更大規模人群數據的研究及驗證。

3 COVID-19 的實驗室檢測方法

3.1 SARS-CoV-2 的分離與培養 病毒學診斷最經典的方法是病毒分離培養。COVID-19 疫情爆發后，浙江省疾控中心和廣東省疾控中心分別2020 年1月24 日和27 日分離出了第一批SARS-CoV-2 病毒株。病毒的分離培養對培養條件要求高，耗時長，臨床難以推廣。但成功分離病毒株，就相當于獲得了“種子庫”，對進一步研究與防治至關重要。2020年3 月5 日，南方科技大學及深圳市第三人民醫院合作發表團隊最新研究成果，成功在BSL-3 實驗室分離純化SARS-CoV-2，并利用透射電子顯微鏡（負染色和cryo-EM）解析了SARS-CoV-2 的病毒結構[14]。這也是首次通過冷凍-EM 對近天然SARS-CoV-2進行成像，為病毒溯源、感染機制、藥物篩選和疫苗研制等奠定了基礎。

3.2 核酸檢測 核酸檢測被公認為是COVID-19 的主要參考依據，WHO 公布的《疑似2019 新型冠狀病毒感染病例實驗室檢測臨時指南》[15]和國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》[1]規定，對確診病例的診斷需具備以下病原學證據之一：①實時熒光RT-PCR 檢測SARSCoV-2 核酸陽性；②病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。

3.2.1 基因測序技術 2020 年2 月7 日，國家生物信息中心（CNCB）/國家基因組科學數據中心（NGDC）首批自主收錄的5 株SARS-CoV-2 基因組序列實現與美國NCBI 核酸數據庫GenBank 數據同步與共享，為全球共同研究及有效防控COVID-19 奠定了基礎。2020 年1 月30 日，中國疾病預防控制中心公布了對9 名新冠確診患者的支氣管肺泡灌洗液樣本中SARS-CoV-2 分離株的二代測序結果；通過獲取的8 組SARS-CoV-2 完整基因組信息橫向對比，發現相似度高達99.98%，鑒于病毒易突變的特點，表明該病毒是近期才感染人類的；對SARS-CoV-2 基因組與已知的冠狀病毒基因組庫縱向對比，發現其與SARS 的相似度79%，與MERS 的相似度50%[5]。澳大利亞科學家發表了首個針對SARS-CoV-2 的直接RNA 測序研究，利用納米孔技術對天然RNA分子進行測序，測序數據可用于識別一系列病毒中存在的堿基修飾，這些修飾可能具有功能性的作用，在影響宿主-病原體相互作用和病毒復制中起到重要的作用[16]。

3.2.2 PCR 技術實時熒光 RT-PCR 是目前診斷COVID-19 最常用的實驗室檢測方法。根據《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南（第二版）》，核酸檢測方法主要針對SARS-CoV-2 基因組中開放讀碼框1ab（ORF1ab）和核殼蛋白（N）；并推薦了引物和探針序列；確診需要同一份標本中2 個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR 檢測結果均為陽性[17]。有研究建立了兩個分別針對ORF1ab 和N 區靶基因的一步實時定量RT-PCR 檢測方法，對比患者的呼吸道樣本檢測結果，發現用該方法檢測N 基因的靈敏度是ORF1ab 基因的10 倍左右[18]。目前已有多個基于實時熒光RT-PCR 的新型冠狀病毒核酸檢測試劑（武漢明德、北京卓誠惠生、圣湘生物、達安基因、上海之江、華大生物、上海捷諾、邁克生物、上海伯杰、金豪制藥和上海復星長征）通過了國家藥品監督管理局的批準，其中10 個產品對兩個靶標（ORF1ab、N）同時進行檢測。

近期，SARS-CoV-2 核酸檢測的“假陰性”引起了廣泛關注。上呼吸道標本（特別是鼻、咽拭子）是最常用的核酸檢測采樣方式，對武漢市紅十字會醫院100 例COVID-19 患者同時留取鼻拭子和咽拭子；鼻拭子取樣標本的SARS-CoV-2 病毒核酸陽性率89%，而咽拭子陽性檢出率僅為54%；這可能與醫護人員在采集咽拭子標本時直接面對患者口腔，暴露風險過大，導致取樣時間較短較糙有關[19，20]。

3.2.3 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增（LAMP）是比普通PCR 的靈敏度更高的一種核酸擴增技術，針對靶基因通常設計4 對引物，恒溫下（65 ℃左右）即可反應，對設備要求低；結果判讀強烈推薦目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化或濁度儀，能有效避免氣溶膠污染；耗時15～60 分鐘。缺點是對引物設計的要求高，開蓋易形成污染。中國疾病預防中心成功研制SARS-CoV-2 等溫擴增快速檢測試劑盒，8～15 分鐘可自動判讀結果。由鐘南山、李蘭娟院士指導設計的“六項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒（恒溫擴增芯片法）”已獲國家藥監局審批批準（注冊證證書號：國械注準20203400178），將LAMP 和芯片有效結合，實現了高通量檢測，并可區分新冠病毒、甲型流感病毒、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸。據悉，雅培開發的基于核酸等溫擴增技術ID NOW 平臺的新型冠狀病毒病的分子即時檢測在5分鐘即可檢測病毒，目前也已獲得美國FDA 授予的緊急使用授權。

3.3 血清學檢測《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》將血清檢測納入COVID-19 的確診依據。截至目前，國家藥品監督管理局已批準多個COVID-19 血清學檢測試劑盒，主要有膠體金法（和信健康、諾唯贊、廣州萬孚、英諾特、珠海麗珠）、化學發光偶法（萬泰凱瑞、博奧賽斯）和酶聯免疫法（海泰生物）。

3.3.1 膠體金免疫層析技術 膠體金免疫層析是以膠體金作為標記物應用于抗原抗體檢測的一種側向流免疫層析技術。鐘南山院士團隊于2020 年2 月28日首次公開了一種基于膠體金免疫層析技術的SARS-CoV-2 病毒IgM-IgG 聯合檢測方法；臨床評價顯示IgM-IgG 聯合檢測的敏感性遠高于IgM 或IgG 單抗體檢測[21]；具有便攜和快速響應性（約15 分鐘），操作簡便，可提供現場即時檢測（POCT）。這類方法可作為核酸檢測陰性的補充檢測，特別適合于出入境檢驗檢疫機構、醫院、檢疫局等進行快速大規模檢測和大范圍普查。但靈敏度有限、難以定量。

3.3.2 化學發光技術 化學發光技術是基于化學發光的敏感性和免疫反應的特異性而建立，再使用對應檢測器測定其發光強度，特異性高，操作簡單。取武漢雷神山醫院191 例確診和疑似COVID-19 患者血清，對比分析膠體金法和化學發光法檢測結果：COVID-19 特異性抗體臨床特異性均為100%；持續陽性組，兩種方法無明顯差異；陽轉陰組和疑似組，化學發光法的總抗體的陽性檢出率顯著優于膠體金法[22]。

3.3.3 酶聯免疫技術 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）通常需用對比雙份不同時期的血清樣本的抗體量進行確診，步驟繁瑣，限制了其臨床應用。

4 總結及展望

目前尚無SARS-CoV-2 的疫苗或特異性藥物，盡早診斷并及時治療和隔離，對于遏制疫情至關重要。基于實時熒光RT-PCR 的核酸檢測是診斷COVID-19 最常用的實驗室檢測方法，但其存在局限性，標本類型和采樣時間等可能會影響檢測陽性率，且依賴相關PCR 實驗室及儀器。血清學檢測主要有膠體金免疫層析和化學發光技術，前者可提供POCT、操作簡便、用時短，后者檢測效率高、靈敏度高；此外血清樣本含毒量低，大大降低了醫護人員暴露風險。血清學檢測可用作COVID-19 的大規模初篩，也能作為核酸檢測陰性的補充檢測，兩者聯合檢測可以提高篩查排查率。隨著對COVID-19 認識的深入，將會有更多的檢測試劑投入使用，一方面要加強對相關產品的的質量控制，另一方面要關注每種檢測的局限性，提倡多種方法相結合，取長補短，增強實用性，提高診斷靈敏度和準確率，從而保障臨床診斷和疫情防控的需求。