少精子癥動物模型的構(gòu)建

許 衛(wèi)

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 義烏 322000）

不孕不育癥約一半由男性因素造成[1]，造成男性不育的原因有很多，少精子癥是其主要原因之一[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）男性不育標(biāo)準(zhǔn)化檢查與診療手冊提供的標(biāo)準(zhǔn)[3]，精子數(shù)小于20×106ml-1的被認(rèn)定為少精子癥。少精子癥可分為輕度少精癥（10×106ml-1～20×106ml-1）、中度少精癥（5×106ml-1～10×106ml-1）和重度少精癥（＜5×106ml-1）。少精子癥的發(fā)生可能與環(huán)境因素、醫(yī)源性干預(yù)、化學(xué)因素、內(nèi)分泌因素等有關(guān)[4]。動物模型構(gòu)建是目前生物醫(yī)學(xué)常用的研究方法，對探索疾病的發(fā)生機(jī)制、治療方法等方面具有重要的科研價值。本文對少精子癥動物模型構(gòu)建的方法總結(jié)如下，以期為進(jìn)一步篩選出建模效果較好的構(gòu)建方法提供參考。

1 化療藥物構(gòu)建動物模型

目前臨床上使用的化療藥物雖在某些疾病的治療上有著重要意義，但其同時會引起機(jī)體免疫抑制、血細(xì)胞異常、細(xì)胞染色體畸變等副作用，少精子癥也是其中之一。常用于少精子癥建模的化療藥物介紹如下。

1.1 環(huán)磷酰胺構(gòu)建動物模型 環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是一種人工合成的烷化劑，主要用于治療惡性腫瘤、風(fēng)濕性疾病[5]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。環(huán)磷酰胺在體外沒有活性，其代謝副產(chǎn)物丙烯醛是主要的毒性因子，具有強(qiáng)氧化性。有研究表明[6]，環(huán)磷酰胺能夠損害男性生殖系統(tǒng)，使精子形態(tài)異常，數(shù)目減少，活力下降，導(dǎo)致男性的少無精子癥。其具體機(jī)制尚未完全明確，可能是通過產(chǎn)生活性氧來誘導(dǎo)生殖細(xì)胞毒性，并引起精原細(xì)胞DNA 合成和精子細(xì)胞RNA 及蛋白質(zhì)的合成水平下降[7]。也有研究表明[8]，環(huán)磷酰胺可通過PP2A 和β-catenin 信號通路對大鼠睪丸造成損傷。韓咪莎等[9]研究認(rèn)為環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)睪丸生精障礙的途徑主要包括：①導(dǎo)致生殖細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡；②干擾A 型精原細(xì)胞分化及自我更新增殖功能；③損傷精子發(fā)生微環(huán)境。用環(huán)磷酰胺建立少精子癥模型時一般采用小鼠，常用的方法有腹腔連續(xù)大劑量注射、腹腔單次超大劑量注射、長期灌胃等，其中最好的是連續(xù)大劑量腹腔注射。許衛(wèi)等[10]按60 mg/kg 給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，每天1 次，連續(xù)5 天，常規(guī)飼養(yǎng)觀察33天，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠精子相對計數(shù)降低，生精小管基底膜變薄，生精細(xì)胞數(shù)目及層次明顯減少，排列紊亂。劉波等[11]持續(xù)5 d 大劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 mg/kg）后，小鼠精子濃度和活力比正常組明顯下降，呈現(xiàn)出明顯的少精子癥。用環(huán)磷酰胺造小鼠少精子癥模型與傳統(tǒng)腺嘌呤、雷公藤甙等相比，具有經(jīng)濟(jì)、周期短、易于控制、便于獲取、便于觀察等優(yōu)點(diǎn)。但隨著濃度的增大，其死亡率也會增加。

1.2 白消安構(gòu)建動物模型 白消安（busulfan，Bu）是一種抗腫瘤藥物，又稱馬利蘭（Myleran），屬氮芥類烷化劑，是甲基磺酸酯類的代表藥物。在雄性生殖生物學(xué)研究中常用于消除生殖細(xì)胞，當(dāng)白消安作用于睪丸時，優(yōu)先作用于精原干細(xì)胞，其次為精母細(xì)胞，導(dǎo)致睪丸曲細(xì)精管中生殖細(xì)胞的發(fā)生過程受到損傷，從而對睪丸發(fā)育產(chǎn)生影響[12]。用白消安腹腔注射法能成功誘導(dǎo)小鼠少無精子癥模型，是研究同種生精干細(xì)胞移植的主要受體模型[13]。其不僅能清除受體睪丸內(nèi)源性精原干細(xì)胞，還能破壞睪丸支持細(xì)胞之間的連接。該藥作為細(xì)胞周期非特異性藥物，主要作用于細(xì)胞的G1期與G0期，通過與細(xì)胞的DNA鳥嘌呤起烷化作用而破壞DNA 的結(jié)構(gòu)與功能[14]。暴國等[15]使用35 mg/kg 白消安在ICR、NIH、Balb/c 三個品系雄性小均可成功建立無精子癥模型，并較40 mg/kg 和45 mg/kg 白消安組造模成功動物的成活率明顯提高。白消安少精子癥小鼠模型在2 個生精周期（70 天）內(nèi)維持基本穩(wěn)定，處于無精子癥或低生精能力狀態(tài)。周雪原等[16]認(rèn)為單次注射15～60 mg/kg 白消安會使實(shí)驗(yàn)大鼠不同程度死亡，連續(xù)10 天累計注射劑量15 mg/kg 白消安可破壞大鼠睪丸組織的部分精原干細(xì)胞，連續(xù)10 天累計注射總劑量20 mg/kg是較為理想的實(shí)驗(yàn)濃度，可消除全部精原干細(xì)胞和大部分支持細(xì)胞，30、40、60 mg/kg 可致大鼠死亡或睪丸病變充血。羅小敏等[17]認(rèn)為10 mg/kg 白消安間隔24 d 二次腹腔注射是建立小鼠精子再生模型的適宜劑量，增大劑量可使支持細(xì)胞GDNF mRNA 表達(dá)不足，導(dǎo)致精子發(fā)生不能完全恢復(fù)。該法操作簡便、效果顯著，但其致畸譜較廣，包括顱骨骨化不全、腭裂、腦積水和肢體的畸形。

1.3 腺嘌呤構(gòu)建動物模型 腺嘌呤（adenine，A）又稱維生素B4，是核酸的組成成分，可參與遺傳物質(zhì)的合成，促進(jìn)白細(xì)胞增生，可用于腫瘤化療時引起的白細(xì)胞減少癥，也可用于急性粒細(xì)胞減少癥。其可造成雄性大鼠睪丸生殖功能障礙，導(dǎo)致精子發(fā)生減少。葛爭艷等[18]研究證明，腺嘌呤構(gòu)建大鼠少精子癥模型，各模型組20 天后血清睪酮明顯下降，隨著建模時間的延長和劑量的增加，精子密度和活力出現(xiàn)不同程度的降低，畸形率上升，并呈一定的時效和量效關(guān)系，肝、腎指數(shù)明顯升高，生殖器官指數(shù)明顯降低，符合少精子癥模型要求。趙羅娜等[19]證明每日200 mg/kg腺嘌呤灌胃5 周，可直接或間接導(dǎo)致大鼠睪丸等性腺器官損傷及臟器系數(shù)降低，進(jìn)而致使精子數(shù)目減少。呂世軍[20]以500 mg/ml 濃度的腺嘌呤按1∶10 與阿拉伯膠助溶后，再以1 ml/（100g·d）的劑量連續(xù)灌胃12 天，能夠降低大鼠精子的密度和活力及血清睪酮T 的水平，導(dǎo)致生精障礙。多數(shù)研究報道使用的腺嘌呤劑量與建模時間不一，且關(guān)于腺嘌呤建?？赡嫘缘馁|(zhì)疑一直存在。因此，如何保持一定濃度腺嘌呤發(fā)揮持續(xù)刺激作用，使腎臟損害程度達(dá)到慢性腎功能衰竭的標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行性發(fā)展，同時保持較低的死亡率，是腺嘌呤模型建模成功與否的關(guān)鍵。

2 普通藥物構(gòu)建動物模型

2.1 醋酸棉酚構(gòu)建動物模型 醋酸棉酚是一種男性避孕藥，服用低劑量醋酸棉酚能阻斷組蛋白-精核蛋白取代反應(yīng)及影響精核蛋白含量，從而導(dǎo)致不育。Santana AT 等[21]研究證實(shí)醋酸棉酚可致大鼠附睪尾精子計數(shù)及后代數(shù)量明顯減少。黃賽金等[22]對大鼠灌胃50 mg/kg 醋酸棉酚，3 天/次，連續(xù)5 次，即可制備少弱精癥大鼠模型。一定劑量的醋酸棉酚經(jīng)口服給藥能誘導(dǎo)形成不同程度少精子動物模型，少精子程度與服藥劑量和時間長短有關(guān)。

2.2 苯甲酸雌二醇構(gòu)建動物模型 苯甲酸雌二醇是一種雌二醇衍生物，屬于人工合成雌激素，皮下注射苯甲酸雌二醇可導(dǎo)致精子、精細(xì)胞及部分精母細(xì)胞脫落，停藥后可恢復(fù)生精功能。張瑞[23]對雄性昆明小鼠分別注射含5 mg/kg、10 mg/kg 苯甲酸雌二醇的玉米油150 μl，隔天1 次，持續(xù)4 周，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組精子懸液顯微鏡下未見精子，生精上皮細(xì)胞排列稀釋，生精小管管腔內(nèi)無精子。黃勛彬等[24]對小鼠注射4 mg/kg苯甲酸雌二醇，持續(xù)15 天，注射后4 周，造成生精功能的損害；但注射后12 周，曲細(xì)精管內(nèi)可見精母細(xì)胞增多，20 周時部分曲細(xì)精管內(nèi)可以找到精子細(xì)胞和精子，這表明小鼠睪丸生精功能部分恢復(fù)。相比化療方法，苯甲酸雌二醇構(gòu)建少精子動物模型死亡率低，但隨著時間延長，小鼠生精小管中發(fā)現(xiàn)精子與精子細(xì)胞存在，缺乏良好的穩(wěn)定性。

3 物理方法構(gòu)建動物模型

3.1 熱效應(yīng)構(gòu)建動物模型 熱效應(yīng)是最經(jīng)典的少精子癥建模方式之一，高溫造少精子癥模型的機(jī)制是阻斷精細(xì)胞囊或伸長的精細(xì)胞囊的發(fā)育，使其退化為異常的生精囊或精子束。Kheradmand A 等[25]用43 ℃水浴局部溫浴大鼠陰囊15 min 成功構(gòu)建少精子癥大鼠模型。Yi XL 等[26]將猴子陰囊浸沒于43 ℃溫水每天30 min，連續(xù)兩天，睪丸局部熱處理使精子數(shù)量減少、活性降低，成功構(gòu)建少精子癥猴子模型。高溫造成的少精子癥大約能在末次高溫處理后維持50 天左右。但熱效應(yīng)僅對部分生精細(xì)胞有影響，對成熟精子與間質(zhì)細(xì)胞無影響。

3.2 電離輻射構(gòu)建動物模型 電離輻射對睪丸組織的影響很大，電離輻射能夠輕易地?fù)p害生精上皮，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使精子數(shù)目顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)[27]應(yīng)用劑量為1400、1600 cGyX 射線局部照射8～10 周齡BALB/C 雄鼠睪丸，能夠成功構(gòu)建少精癥動物模型；而當(dāng)劑量為2000 cGy 時，雄鼠發(fā)生死亡。其作用機(jī)理為誘發(fā)染色體畸變，畸變率與照射劑量呈正相關(guān)。由于可能造成睪丸生精功能的永久性損傷，所以在藥物篩選或藥物效果評價時不宜采用此種建模方式。

4 基因敲除構(gòu)建動物模型

基因敲除技術(shù)是應(yīng)用DNA 同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，整合入受體細(xì)胞的基因組中，從而達(dá)到基因敲除的目的。利用基因工程技術(shù)，敲除生精過程相關(guān)基因，如敲除小鼠TPPP2基因可導(dǎo)致精子數(shù)量和活力顯著降低，成功構(gòu)建少精子癥模型[28]。但基因敲除方法存在較多弊端，構(gòu)建難度也較大，且價格昂貴，限制了其應(yīng)用范圍。

5 總結(jié)

目前少精子癥動物模型構(gòu)建的方法多樣化，每種模型的制備方法和機(jī)理有所不同，且存在著諸多局限性，如化療藥物法在對生精功能損傷的同時，對機(jī)體其他系統(tǒng)的功能也會造成損傷，因此很難排除由此造成的動物代謝功能損傷對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。所以我們需要根據(jù)我們研究目的選擇不同類型的少精癥動物模型構(gòu)建方法，并且在此基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化，構(gòu)建出一種更有效的穩(wěn)定可靠的少精癥動物模型，以達(dá)到更好的建模效果，為進(jìn)一步研究少精子癥的發(fā)生發(fā)展和治療建立良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。