環狀RNAs對糖尿病微血管并發癥作用的研究進展

龔蕓 周嘉強

糖尿病微血管病變作為糖尿病最常見的并發癥，嚴重威脅人類的生命健康，是導致糖尿病患者致死、致殘的重要原因之一[1]。研究表明內皮受損、氧化應激、代謝異常等多因素參與了糖尿病微血管病變病理機制。然而，其明確的發病機制至今仍未完全闡明[2]。因此，對于糖尿病微血管并發癥的研究一直是糖尿病領域關注的熱點與難點。近年來研究證實，在糖尿病患者和健康受試者外周血中能夠檢測到環狀RNAs（circular RNAs,circRNAs）存在顯著性差異表達，并且circRNAs可調節胰島β細胞功能，影響機體胰島素分泌，說明circRNAs對糖尿病的發生、發展起著重要的調控作用[3]。circRNAs是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共價結合所形成閉合環狀結構的一類內源性的非編碼RNA分子，在物種間高度保守，具有穩定性、多樣性及一定的疾病特異性，可通過轉錄、轉錄后及翻譯等水平調控基因的表達，廣泛參與機體的病理生理過程[4-5]。本文旨在通過介紹circRNAs的結構特點、生物學特性，對circRNAs與糖尿病微血管并發癥發生、發展的關系作一綜述。

1 環狀RNA概述及其生物學功能

20世紀70年代，科學家首先在RNA病毒中發現了circRNAs，但由于其表達水平較低，當時被認為是由于可變剪切出錯形成的，甚至被認為是實驗操作因素或是遺傳異常造成的，沒有引起學術界的重視[6]。然而，隨著RNA測序技術的跨越式發展以及生物信息學手段不斷成熟，在人類、小鼠、線蟲和植物等多細胞生物中發現成千上萬種circRNAs[7]。circRNAs的形成方式主要有以下2種：（1）通過內含子的反義互補序列配對，使3′端剪切供體鄰近5′端剪切受體，從而攻擊受體，形成環狀結構。（2）外顯子反剪接和跳躍剪切后，剪切片段形成內部套索結構，誘導其成環[8]。

盡管circRNAs的表達普遍較低，并且不是真核轉錄組中的主要成員，但是由于其特殊的拓撲結構使得circRNAs在某些特殊的時空中發揮了重要作用，其可通過調控轉錄、微小RNA（miRNA）分子海綿功能、干擾可變剪切、結合RNA結合蛋白等方式發揮豐富的生物學功能[9]。目前在動物研究中所涉及的功能如下：（1）調控轉錄及剪切過程：由于絕大多數的circRNAs來源于編碼基因的外顯子，這些過程能夠通過競爭外顯子來影響mRNA前體的剪切過程，從而進一步改變基因表達。（2）circRNAs作為內源性mRNA的競爭者，是miRNA的海綿吸附體：研究表明circRNAs有很多miRNA的結合位點，可作為miRNA的海綿吸附體，抑制miRNA的翻譯功能。（3）編碼蛋白質：由于缺乏帽子和poly（A）尾巴，circRNAs并不能依賴經典的m7G帽子結構途徑進行翻譯。近幾年的研究表明，一小部分circRNAs具有編碼潛能，當內部核糖體進入位點（internal ribo some entry sites，IRESs）元件插入到起始密碼子AUG的上游時，能夠啟動翻譯。除了IRES途徑，N6-甲基腺苷（m6A）修飾能夠直接影響circRNAs翻譯過程。雖然不依賴帽子的翻譯方式效率較低，但circRNAs編碼過程一般都發生在逆境條件下，可能作為實現某些功能的補充。（4）與RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用：circRNAs能夠與不同的蛋白質相互作用形成特定的circRNA-蛋白質復合物，改變相關蛋白質的構象從而調控彼此的功能[10-12]。

2 circRNAs參與糖尿病微血管并發癥的發生、發展

隨著糖尿病病程加重，患者會出現多種血管并發癥，如何有效地阻遏糖尿病患者血管并發癥的發生與發展，是糖尿病研究學界亟待解決的難題。糖尿病血管病變主要包括大血管病變和微血管病變，大血管病變主要累及主動脈、冠狀動脈等大血管，以動脈粥樣硬化為主要特征；微血管病變是糖尿病特有的慢性血管并發癥，主要表現為視網膜病變、神經系統病變、腎臟病變等。在糖尿病微血管并發癥中，circRNAs發揮了舉足輕重的作用[13]。

2.1 circRNAs與糖尿病腎病糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的微血管并發癥，是導致終末期腎病的主要原因。研究發現，高血糖狀態下系膜細胞增殖、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）積累、氧化應激和炎癥的異常調節是DN發生、發展的重要因素。Hu等[14]通過circ RNAs表達譜芯片分析發現circRNA_15698在db/db DN小鼠和暴露于高糖（25 mM）的小鼠系膜細胞（SV40-MES13）的表達水平較對照組明顯升高。機制研究發現circRNA_15698可作為miR-185的“分子海綿”，調控轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）蛋白的表達，促進了ECM相關蛋白的合成，從而促進DN的進展。circHIPK3在DN小鼠組織和大鼠系膜細胞中的表達上調；下調circHIPK3表達能夠抑制系膜細胞增殖，并顯著降低周期蛋白D1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、TGF-β1、Ⅰ型膠原（collage I，COL-I）和纖維連接蛋白（fibronectin，FN）的表達；同時circHIPK3可以特異性地海綿化miR-185，沉默miR-185可以逆轉circHIPK3對上述蛋白的抑制作用，說明circHIPK3可以通過miR-185促進DN的進展[15]。Liu等[16]證實circ_0080425的表達與DN的進展相關，并對系膜細胞增殖和纖維化產生積極影響。進一步研究表明，circ_0080425充當miR-24-3p的海綿，抑制miR-24-3p表達，影響下游成纖維細胞生長因子11（fibroblast growth factor 11，FGF11）的表達，進而促進腎系膜細胞增殖和纖維化，而FGF11的敲除導致細胞增殖率和纖維化明顯降低，說明circ_0080425與miR-24-3p的競爭性結合可以從miR-24-3p的抑制中釋放FGF11，從而促進DN的進展。Peng等[17]研究發現在高糖條件下培養的糖尿病腎臟、系膜細胞和腎小管上皮細胞中circRNA_010383表達水平明顯下調；過表達circRNA_010383抑制了db/db小鼠的蛋白尿和腎纖維化，提示circRNA_010383可能是未來DN治療的新靶點。上述結論表明circRNA可能參與DN系膜細胞的增殖和纖維化。Chen等[18]報道上調的circLRP6通過在高糖條件下海綿化miR-205來調節系膜細胞損傷，同時通過海綿化miR-205、上調高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和激活toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號途徑來調節高糖誘導的系膜細胞增殖、氧化應激、ECM積聚和炎癥。此外，有研究報道circAKT3作為miR-296-3p的海綿，通過調節miR-296-3p/E-cadherin信號抑制DN系膜細胞外基質的積聚，為DN的臨床診斷靶點和治療生物標志物提供了新的潛在機會[19]。這些結果提示circRNAs可能是DN發病的關鍵調控因子，為進一步了解DN的發病機制提供了依據。

2.2 circRNAs與視網膜病變糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常發生的并發癥之一，是導致患者視力損害和失明的主要原因。DR主要是由于高血糖條件下視網膜微血管循環改變，包括內皮細胞增殖和通透性增加、異常新生血管和水腫；血糖水平升高會導致氧化應激、炎癥、神經元功能障礙、視網膜神經節細胞凋亡和膠質細胞激活[20]。Gu等[21]通過環狀RNA表達譜芯片分析19例DR患者和無DR患者血清中的差異表達水平，結果發現30個顯著上調的circRNAs，提示這些circRNAs參與DR的疾病進展。Wu等[22]通過對DR患者和非DR患者的全血進行高通量全轉錄組測序檢測circRNAs的差異表達情況，并通過qRT-PCR對候選circRNAs進行驗證。結果發現，circ_0001953在區分DR患者與非DR患者和健康對照者時具有較高的診斷準確性。說明全血circ_0001953可作為DR患者新的診斷標志物和潛在的治療靶點。Zhang等[23]確定了529個在DR和非DR患者之間差異表達的circRNAs，實驗證實circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體樣本以及纖維血管膜中高表達，其作為miR519d3p的海綿吸附體，抑制其活性，引起miR519d3p下游靶基因基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）和信號轉導轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達上調，從而調節內皮細胞增殖、遷移和基質膠管形成，促進視網膜內皮血管生成。circDNMT3B在糖尿病視網膜微血管內皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）中表達下調，且circDNMT3B過表達可減少糖尿病大鼠視網膜微血管內皮細胞數量，減輕視覺損傷。circDNMT3B作為miR-20b-5p海綿，促進BAMBI表達而導致糖尿病視網膜血管功能障礙，提示circDNMT3B可作為DR潛在的治療靶點[24]。circZNF532在糖尿病應激下的周細胞、糖尿病小鼠模型的視網膜血管和糖尿病患者的玻璃體房中的表達上調，其充當miR-29a-3p海綿并誘導硫酸軟骨素蛋白聚糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）、賴氨酰氧化酶樣蛋白2（Lysyl oxidase-like 2，LOXL2）和細胞周期蛋白依賴激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表達，從而改善糖尿病玻璃體誘導的視網膜周細胞變性和血管功能障礙[25]。葛慧敏等[26]發現circPWWP2A通過海綿樣吸附miRNA-579以發揮競爭性內源RNA（ceRNA）的作用，導致下游靶基因Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1表達的增加，從而參與調控周細胞功能及周細胞與內皮細胞間的串擾，進而加重了糖尿病性視網膜微血管病變的過程。說明誘導circZNF532和circPWWP2A可成為一種新的DR治療方法。細胞凋亡、炎癥和氧化應激是DR進展的標志。結果發現circRNA_0084043的缺失顯著提高了內皮細胞存活率，抑制了高糖誘導的細胞凋亡，降低氧化應激活性，有效抑制高糖刺激的炎癥反應；同時研究發現circRNA_0084043能夠通過海綿化miR-140-3p和誘導視網膜內皮細胞轉化生長因子α（transforming growth factorα，TGFA）表達參與DR的進展[27]。circHIPK3在糖尿病視網膜中的表達顯著上調，并作為內源性miR-30a-3p海綿，導致血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）和無翅基因相關整合位點2（Wnt2）表達增加，從而導致炎癥和血管功能障礙[28]。另有研究報道circZNF609在糖尿病小鼠視網膜血管細胞及高糖培養的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中表達明顯上調，circZNF 609可充當內源性miR-615-5p海綿并抑制其表達，導致肌細胞增強因子2基因（myocyte specific-enhancer factor 2，MEF2A）表達增加，促進病理性血管生成和內皮細胞氧化應激損傷，從而促進DR進展[29]。目前大多數學者的研究均集中在circRNAs通過ceRNA機制，調控其下游靶基因的表達進而參與DR進展。circRNAs在DR發生、發展中的其他分子機制有待更深入的研究。

2.3 circRNAs與糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）DPN是糖尿病最常見、最棘手的并發癥，約1/3的糖尿病患者患有DPN，給糖尿病治療帶來巨大的經濟負擔[30]。目前有關circRNAs在周圍神經病變研究較少。Zhang等[31]通過對野生型和糖尿病小鼠進行高通量測序鑒定差異表達circRNAs，結果共鑒定出15個差異表達的circRNAs以及133個差異表達的mRNAs，提示circRNAs可能參與了DPN mRNA表達的調控。外源性沉默circRNA ACR可以降低miR-145-3p的表達，激活PI3K/AKT/mTOR信號通路來減輕高糖引起的大鼠雪旺細胞系細胞RSC96的細胞凋亡、自噬和以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成[32]。糖尿病神經痛是晚期神經病變，嚴重影響患者的生活質量。Wang等[33]研究發現circHIPK3在患有神經源性疼痛的糖尿病患者血清和鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠背根神經節中高表達，且circHIPK3表達上調與2型糖尿病患者的神經源性疼痛程度呈正相關。circHIPK3在STZ誘導糖尿病大鼠背根神經節表達水平及疼痛評分明顯增加，而沉默circHIPK3可降低疼痛評分，減少DPN所致的神經型疼痛。研究發現慢性坐骨神經壓迫損傷大鼠模型（chronic compression injury，CCI）中circ_0005075明顯增加，下調circ_0005075表達能夠誘導miR-151a-3p表達下調和阻斷NOTCH2，從而導致靶向環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白介素6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的下調來抑制神經炎癥，緩解神經源性疼痛[34]。此外，Wei等[35]類似的研究發現在CCI大鼠模型中circZRANB1表達下調，其通過海綿狀吸附miR-24-3p，調控LPAR3表達，介導Wnt5a/β-Catenin信號通路促進神經病理性疼痛。上述這些研究結果說明circRNAs在DPN及其神經病理性疼痛中可能發揮重要的調控作用，其具體的相關機制有待進一步的探究。

3 展望

近年來，隨著高通量技術和生物信息學的快速發展，研究者發現許多circRNAs在糖尿病及其并發癥的發生、發展過程中發揮著關鍵的角色，深入探究circRNAs在糖尿病及其微血管并發癥中的作用及具體分子機制，將有希望為糖尿病微血管并發癥的防治工作提供參考和理論依據。然而，既往大多數研究均集中在circRNAs通過競爭性內源RNA機制參與糖尿病血管并發癥疾病進展，并且關于circRNAs生物學功能尚處在研究階段。因此，需要進一步探索并揭示circRNAs在糖尿病微血管并發癥的確切機制，circRNAs能否成為糖尿病微血管并發癥診斷、治療和預后的標志物，仍是未來需要不斷探索的問題。