蛋白激酶C-βⅡ在糖尿病腎病中的研究進展

姜樂臨 葉凡豪 韓絲絲 黃時偉

在臨床診斷與介入治療中，對比劑的應用較多，其主要通過腎臟排泄。對比劑腎損傷是指使用對比劑48 h內發生的腎功能損害，表現為血清肌酐絕對值增加至少44 μmol/L或相對基線增加至少25%。該病是住院患者急性腎功能不全的第三大原因[1-2]。糖尿病是對比劑介入后腎功能障礙的主要危險因素之一，而蛋白激酶C-βⅡ（protein kinase C βⅡ，PKC-βⅡ）在糖尿病腎病中起著重要作用，本文就其相關研究進展作一綜述。

1 PKC-βⅡ結構及分子功能

PKC-βⅡ是單個多肽鏈，包含由5個可變區（V1～V5）間隔的4個保守結構域（C1～C4）。假底物結構域C1、C2、V1、V2、V3的一部分構成調節結構域，存在于氨基末端。C3、C4、V4和V5在羧基末端形成催化結構域，并且這2個結構域通過蛋白水解敏感鉸鏈區連接。

假底物占據C1結構域的末端并介導酶的自動抑制，它與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）底物具有序列同一性，丙氨酸取代絲氨酸/蘇氨酸磷酸受體位點。因此，在酶的無活性狀態下，假底物結構域阻斷底物結合腔并在活化過程中從活性位點釋放并引起酶的完全活化[3]。C1結構域（約70個氨基酸）是緊湊的，富含半胱氨酸并由5個短β鏈、α螺旋和2個Zn2+組成，并形成DAG和PD結合位點。C1結構域分為2個部分，即C1a和C1b，共享高度的序列相似性。中心體蛋白Pericentrin、RING指蛋白是與C1a區相互作用的2種蛋白[4]，前者負責紡錘體形成和胞質分裂，這種相互作用的破壞可抑制細胞分裂；后者過表達導致PKC-βⅡ蛋白化和降解。因此，通過與PKC-βⅡ的C1結構域結合，這些蛋白質可以改變酶的亞細胞定位和活性[4]。C2結構域由通過環連接的8個反平行β鏈形成，其由多個天冬氨酸殘基排列，而天冬氨酸殘基與3個Ca2+配位來充當C2結構域和磷脂頭部基團之間的橋梁。活化C激酶（RACK）-1（36 kDa）受體的蛋白質由7個重復的WD40基序組成，以螺旋槳狀結構排列，與PKC-βⅡ相互作用并穩定其活性形式，從而提高基質的磷酸化效率。C3結構域被認為是三磷酸腺苷結合的高度保守位點，且該結構域的序列對于PKC-βⅠ和PKC-βⅡ同工酶是相同的[5]。三磷酸腺苷結合位點突變可消除激酶活性。C4結構域是底物結合位點，參與磷酰基轉移。它是所有PKC中的保守區域，具有105～108個氨基酸的保守序列，這些序列在三磷酸腺苷結合位點末端開始并持續至磷酸轉移基團的開始。V5區域由50～70個氨基酸組成，在PKC的定位和磷酸化中起重要作用。它具有多種功能，具有不同異構體的功能，也可導致酶在不同組織中以不同方式定位。Kiley等[6]分析了V5區域對人U937單核細胞系的影響，結果顯示PKC-βⅠ定位于微管，PKC-βⅡ部分定位于分泌顆粒。Blobe等[7]在MOLT-4 T淋巴母細胞樣細胞系中也證實了這種定位效應，觀察到PKC-βⅡ而非PKC-βⅠ在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）處理細胞后易位至肌動蛋白微絲。鉸鏈區由殘基422-425限定，殘基422-425連接調節區和催化區。它被蛋白水解酶破壞，并被確定為半胱氨酸蛋白酶依賴性切割、酪氨酸磷酸化和蛋白質-蛋白質相互作用的靶標。

2 PKC-βⅡ作用機制及通路

PKC在平滑肌細胞、巨噬細胞、內皮細胞等細胞中廣泛表達，在細胞內信號轉導中起重要作用[8]。PKC有3個不同的亞型：常規PKC（α、βⅠ/Ⅱ、γ）、新型PKC和非典型PKC[9]。高糖環境可導致組織中二酰甘油水平普遍升高，進而激活PKC-β。

PKC-β能夠激活一系列下游信號通路，引發多組織器官發生病變，引起糖尿病相關并發癥（如糖尿病腎病等）。因此，糖尿病腎病的新型治療藥物研究早期集中在PKC上[10-11]。某實驗在糖尿病2型大鼠模型中觀察到晚期糖基化終產物的積累和多元醇通路的激活，同時PKC-β表達增加，促炎癥介質（如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等）被釋放，腎臟出現炎癥反應，進而導致蛋白尿和腎纖維化[12]。上述結果提示PKC-β與腎纖維化有關。在糖尿病大鼠模型中，高血糖導致糖尿病腎病加重，腎小球內皮細胞凋亡，提示PKC-β通過加劇腎小球內皮細胞凋亡進導致糖尿病腎病。

3 PKC-βⅡ抑制劑LY333531

LY333531是PKC-βⅡ特異性抑制劑，通過與PKC-βⅡ的活性位點結合，進而干擾三磷酸腺苷的結合并抑制底物的磷酸化。目前LY333531已在糖尿病腎病的多種嚙齒動物模型中進行測試，包括鏈脲佐菌素大鼠，鏈脲佐菌素-REN2大鼠（鏈脲佐菌素導致糖尿病的遺傳性高血壓模型）、db/db小鼠（一種發展為糖尿病和腎臟疾病的肥胖遺傳模型）等，結果顯示腎小球高濾過率正常化，同時蛋白尿、轉化生長因子-β和細胞外基質蛋白減少[13]。此外，LY333531治療還能減少系膜擴張，改善腎小球硬化和腎小管間質纖維化。加用血管緊張素轉化酶抑制劑后，LY333531能進一步減少蛋白尿，緩解腎小球硬化嚴重程度和內皮細胞丟失。相關研究表明，在敲除PKC-β基因或用PKC-β抑制劑治療的糖尿病大鼠中，腎臟肥大、腎小球超濾、細胞外基質產物及活性氧的生成減少，糖尿病腎病得到緩解[14]。在糖尿病大鼠模型和人腎近端小管上皮細胞培養中，研究發現還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧 化 酶、PKC-β、p66shc表達均明顯增加；而PKC-β抑制劑能逆轉高濃度葡萄糖誘導的p-p66shc/p66shc、NADPH氧化酶升高[15]。在細胞培養模型中，大鼠系膜細胞轉化生長因子-β和細胞外基質蛋白表達均明顯增加，以應對糖尿病狀態下的高血糖和其他異常代謝產物（如增加的氨基酸和晚期糖基化終產物等）[16]。

在糖尿病小鼠中，高血糖引起腎病加重、腎小球內皮細胞凋亡的同時，伴隨著促凋亡蛋白Swiprosin-1表達顯著增加。而LY333531能減少糖尿病小鼠中腎小球內皮細胞凋亡，降低Swiprosin-1表達。腎小球內皮細胞中Swiprosin-1過表達，可導致細胞凋亡以及半胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3和Bax表達均明顯增加。相反的，Swiprosin-1的敲除可減弱高葡萄糖或PMA誘導的腎小球內皮細胞細胞凋亡。此外，Swiprosin-1過表達可促進Swiprosin-1和半胱氨酸蛋白酶-9之間的相互作用，增加凋亡小體的形成。與糖尿病Swiprosin-1+/+小鼠相比，糖尿病Swiprosin-1-/-小鼠腎臟重量/體重降低，尿蛋白、腎小球肥大、線粒體凋亡相關蛋白以及腎小球內皮細胞凋亡均明顯改善[17]。在糖尿病腎病早期，Swiprosin-1表達被PKC-β上調，同時PKC-β通過線粒體依賴性途徑促進腎小球內皮細胞凋亡[17]。在人腎小球系膜細胞中，葡萄糖和（或）轉化生長因子-β1誘導PKC-α、PKC-β的基因表達增加，使用siRNA法能減弱其表達[18]。相關數據表明，PKC-α或PKC-β在糖尿病腎病患者蛋白尿和細胞外基質積聚的發病機制中起關鍵作用[19]。Wang等[17]研究發現，LY333531能顯著降低糖尿病大鼠血清肌酐水平、腎臟重量/體重和尿蛋白排泄量，且下調轉化生長因子-β1、Smad2和Smad3 mRNA表達，預防GRAP蛋白表達降低。有文獻報道LY333531的腎臟保護作用可能是由于轉化生長因子-β1/Smad通路的下調和GRAP蛋白表達的正常化實現的[20]。

4 小結

PKC-βⅡ在糖尿病腎病的發生、發展過程中發揮重要作用。PKC-βⅡ抑制劑LY333531可以通過抑制PKC-βⅡ的激活來阻斷下游信號通路，從而起到治療糖尿病腎病的作用。隨著PKC-βⅡ相關研究的深入，PKC-βⅡ特異性抑制劑治療糖尿病并發癥將有更廣闊的前景。