豐富環境對血管性癡呆大鼠神經炎癥和反應性星形膠質細胞的影響

林璐，周甜甜，郝赤子，廖維靖

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是第二常見的癡呆類型，占癡呆病人的15%左右[1]。VaD的患病風險大約每3～5年增加一倍[2]，隨著我國人口老齡化，VaD患病人數將大幅上升。認知障礙與跌倒的發生密切相關[3]，對患者安全造成極大威脅。雖然部分治療阿爾茲海默病的藥物能改善VaD癥狀，但仍面臨耐藥性和經濟負擔重的問題。VaD主要表現為學習和記憶缺陷。海馬的損傷是認知缺陷的主要原因。研究表明，神經炎癥抑制海馬神經發生，導致VaD認知障礙[4-5]。最近的研究指出，抑制炎癥可以緩解嚙齒類低灌注模型的行為缺陷[4]。星形膠質細胞參與介導VaD海馬神經炎癥，占大腦所有膠質細胞的20%～40%[6]。腦損傷時，星形膠質細胞迅速作出反應并發展為反應性星形膠質細胞。豐富環境(enriched environment，EE)具有神經保護作用，已被廣泛應用于神經系統疾病的研究，例如卒中[7-8]，阿爾茲海默癥和腦損傷[9]。此外，研究表明EE能夠提高海馬相關學習和記憶任務的表現，對老年大鼠的海馬功能有顯著作用[11-13]。但是，很少證據表明EE能夠減輕VaD的神經炎癥。此外，探究EE、VaD神經炎癥和星形膠質細胞三者關系的研究更是寥寥無幾。本研究探索EE對VaD大鼠神經炎癥和反應性星形膠質細胞的作用，旨在為臨床治療VaD提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 成年Sprague-Dawley雄性大鼠購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。所有大鼠居住在SPF級環境(4只/籠，22～24℃，12h晝夜循環，相對濕度50%～60%)，提供充足的飲用水和食物。所有的實驗步驟均獲武漢大學動物倫理委員會批準(No：2019130)。分組前排除怕水、活動緩慢的大鼠。36只大鼠隨機分3組：假手術組，模型組和模型+EE組，每組12只。見圖1。

圖1 實驗時間線

1.2 方法 ①制作動物模型：模型組和模型+ EE組均接受永久性雙側頸總動脈結扎術(2-vessel elusion，2-VO)，過程參照Du等[11-13]的所述。使用10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠，將其固定在加熱墊上，直腸溫度保持在37～38℃。沿頸正中線切開，暴露右側頸總動脈，使之與迷走神經分離，結扎該側頸總動脈近端和遠端并從中間剪斷。用同樣的方式結扎左側頸總動脈。假手術組大鼠進行相同的手術流程，但沒有結扎頸總動脈。所有大鼠術后3d均生活在標準環境，并進行水迷宮實驗，檢測模型是否成功。模型成功率為88.9%(成功24只，死亡3只)。②環境干預：EE和標準環境下的大鼠均可自由飲水和進食。標準環境使用正常尺寸的籠子(44 cm×32 cm×20 cm，4只/籠)。EE籠(90 cm×75 cm×50 cm，12只/籠)配備許多玩具，包括跑輪、各式PVC管道、秋千、臺階和彩色的海洋球、鈴鐺及串珠，每天變換這些玩具的位置。模型+EE組大鼠在EE籠中活動4h/d(8：00～12：00)，其余時間居于標準籠。干預自術后第4天始，持續28d。

1.3 評定標準 ①Morris水迷宮用于評估大鼠的學習及空間記憶能力[16]：干預期后進行水迷宮實驗，具體操作如前所述[17]。前五天進行定向航行訓練，大鼠面朝池壁，每天從四個象限分別入水一次，記錄大鼠尋找平臺所花時間。若60s內未找到平臺，便將大鼠引導至平臺處并停留20s，逃避潛伏期記為“60s”。第6天空間探索測試時將移走平臺，大鼠從東南象限入水，記錄60s內大鼠在西北象限花費的時間、穿越原平臺的次數及游泳速度。數據由動物視頻跟蹤分析系統(Anilab科學儀器有限公司，寧波，中國)記錄。②采用原位末端轉移酶標記(terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL)染色(試劑盒11684817910，Roche)檢測海馬細胞凋亡：VaD海馬CA1錐體神經元易損傷是認知障礙發生的關鍵[18]。如前所述[17]，將4μm厚切片脫蠟、破膜后，浸入末端脫氧核苷酸轉移酶( terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT )：脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate ，dUTP)=1：9的反應混合物中，37°C水浴鍋孵育60 min，PBS(pH = 7.4)洗滌3次。用4′，6 -二脒基- 2 -苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole ，DAPI，AS1075，Wuhan)覆蓋切片上，室溫孵育5min，洗凈后在熒光顯微鏡下觀察。用Image-Image-Pro Plus計定量海馬CA1區的TUNEL陽性細胞，每個樣本選取3個視野(×400)并求平均值。③實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測海馬白細胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)：IL-1β是一種細胞因子，在細胞活化、增殖和分化中起主要作用[19]。如前所述[17]，使用TRIpure(EP013，ELK Biotechnology)從海馬組織中提取RNA。采用EntiLinkTM第一鏈cDNA合成試劑盒(EQ003，ELK Biotechnology)合成第一鏈cDNA。使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒(EQ001，ELK Biotechnology)和tepOneTMReal-Time PCR儀(Life Technologies公司)進行檢測。用2-ΔΔCT分析RT-qPCR檢測的基因表達相對變化。β-actin作為內參。cDNA序列如下：β-actin 上游為5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′(110)，下游為5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′(110)。 IL-1β 上游為5′-ATGAAAGACGGCACACCCAC-3′(156)，下游為5′-GGTGCTGATGTACCAGTTGGG-3′(156)。④免疫熒光雙標法標記海馬的星形膠質細胞的神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和脂質運載蛋白-2(lipocalin-2，LCN2)：GFAP和LCN2的上調是出現為反應性星形膠質細胞的標志物[20-21]。LCN2作為反應性星形膠質的自分泌因子，參與調節VaD的神經炎癥[21]。4μm厚的海馬石蠟冠狀切片脫蠟后，依次加入50μl稀釋的一抗(GFAP(1∶300)、LCN2(1∶100))和二抗。隨后每個切片滴加50 μl DAPI染色液，室溫避光孵育5min后滴加適量的抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下觀察(OLYMPUS， IX51)。用成像系統(MicroPublisher，Q-IMAGING)定量IOD/面積，每個切片取3個視野(500μm×500μm)并求平均值。

2 結果

2.1 EE對大鼠學習和空間記憶能力的影響 環境干預28d后進行水迷宮實驗。從定向航行訓練的第2天開始，模型組的逃避潛伏期明顯長于假手術組(P<0.05)，第3天開始模型組的逃避潛伏期也比模型+EE組更長(P<0.05)，這種差異一直持續到定向航行訓練的第5天。雖然模型+EE組大鼠的逃避潛伏期在訓練中不斷縮短，但始終高于假手術組(P<0.05)。見表1。在水迷宮實驗的第6天的空間探索測試中。模型組大鼠在目標象限停留時間少于假手術組(P<0.05)，也少于模型+EE組(P<0.05)，模型+EE組和假手術組之間的差異同樣具有統計學意義(P<0.05)；此外，3組穿越原平臺的次數也大有不同(P<0.05)，假手術組穿越次數最多，其次是模型+EE組，模型組最少；3組2-VO大鼠平均游泳速度的差異不具有統計學意義。見表2。

表1 干預28d后3組大鼠逃避潛伏期的比較

表2 干預28d后3組大鼠在空間探索測試中的比較

2.2 EE對大鼠海馬神經元的影響 Tunel染色的結果顯示，干預28d后，模型組大鼠海馬組織神經元凋亡的數量遠大于假手術組(P<0.05)，模型+EE組神經元凋亡的數量明顯小于模型組(P<0.05)，但仍高于假手術組(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 干預28d后3組大鼠海馬CAI區神經元凋亡比較(%，×400)

2.3 EE對VaD大鼠海馬炎性因子的影響 28d的環境干預后，3組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β的表達差異有統計學意義(P<0.05)。模型組IL-1β mRNA含量高于其他組(P<0.05)，模型+EE組的炎癥因子的含量比假手術組高(P<0.05)。見表3。

2.4 EE對VaD大鼠海馬區反應性星形膠質細胞的影響 免疫熒光的結果顯示，28d的環境干預后，模型組GFAP水平明顯高于其他2組(P<0.05)。而假手術組與模型+EE組之間的GFAP IOD/Area無明顯差異。模型組LCN2 IOD/Area最高，其次是模型+EE組，假手術組LCN2最低，且3組之間的差異存在統計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 干預28d后3組大鼠海馬區反應性星形膠質細胞的比較(%，×400)

表3 干預28d后3組大鼠海馬細胞凋亡、IL-1β、反應性星形膠質細胞相關蛋白的比較

2.5 相關性分析 Spearman相關系數(rs)顯示，環境干預28d后，大鼠在目標象限停留時間與炎癥因子IL-1β(rs=-0.859，P<0.05)和GFAP(rs = - 0.830，P<0.05)、LCN2(rs = -0.866，P<0.05)顯著負相關。見圖4。

3 討論

2-VO模型是大鼠慢性全腦缺血最常見的模型，學習和記憶的缺陷明顯，可較好模擬人類VaD的慢性腦低灌注病理生理過程。因此，2-VO模型廣泛用于VaD的研究[14,22]。本研究中2-VO大鼠在水迷宮實驗中的表現明顯不如假手術組，TUNEL染色的陽性細胞比例及海馬中GFAP的相對量均顯著高于正常水平，這與先前的研究一致[14,22]，顯示復制的2-VO大鼠模型是和血管性癡呆病理特征相符的。由于2-VO大鼠視力可能受損，故本研究對游泳速度進行分析，排除了2-VO模型視力障礙對認知表現的影響，認為EE減輕了2-VO大鼠的認知障礙。

圖4a～c 干預28d后大鼠認知功能與海馬區IL-1β、GFAP和LCN2的相關性分析

既往研究表明，炎癥可能在腦缺血的慢性康復過程中導致認知障礙[24]。炎癥因子會加劇炎癥反應和神經元損傷[25]。其他研究發現，IL-1β的增加顯著損害了海馬的空間記憶[26]。本研究中，VaD大鼠海馬炎癥因子IL-1β顯著增加，EE的介入下調了IL-1β的表達。在之前的研究中，EE還通過降低腦部炎癥因子的表達來減輕阿爾茨海默病大鼠的記憶喪失[9]。因此，本研究認為EE能夠通過下調炎癥因子，降低海馬神經炎癥。抗炎作用可能是EE減輕認知障礙的潛在機制。

星形膠質細胞在VaD海馬神經炎癥中發揮重要作用。先前的研究證實星形膠質細胞維持大腦的正常生理功能[27]。星形膠質細胞增殖被認為與腦缺血后功能恢復有關。相反，先前也有研究表明星形膠質細胞參與調節VaD的病理生理過程[28]。本研究顯示2-VO術后應激形成的反應性星形膠質細胞會分泌IL-1β，上調海馬神經炎癥，并認為EE下調了VaD大鼠海馬區的反應性星形膠質細胞。Rodriguez-Arellano等[28]也發現，環境刺激可調節阿爾茨海默病中的星形膠質細胞。不同的研究證實了星形膠質細胞在VaD中的積極作用和消極作用，一種可能的解釋是，大腦中存在兩種扮演不同角色的反應性星形膠質細胞[27]。

A1反應性星形膠質細胞分泌LCN2和炎性因子(包括IL-1β和NO等)，發揮消極作用；A2反應性星形膠質細胞發揮積極作用，負責產生神經營養因子[27]。研究表明A1反應性星形膠質細胞與認知表現下降有關[30]。因此，本研究認為EE通過下調海馬區反應性星形膠質細胞，減少IL-1β，發揮抗炎作用。

研究表明，LCN2可通過激活星形膠質細胞，誘導炎癥因子(IL-1β)放大神經炎癥，進一步破壞海馬，可能導致VaD患者的認知缺陷[21]。雖然本研究發現EE可以抑制VaD大鼠海馬區反應性星形膠質細胞的過度表達，但尚不能明確上述反應性星形膠質細胞的類型，以及EE對A1和A2反應性星形膠質細胞的影響是否不同。將腦損傷后的星形膠質細胞定向誘導為A2反應性星形膠質細胞和開發抗海馬神經炎癥的藥物可成為VaD認知障礙治療的新方向。由于實驗室條件有限，本研究并未使用激光多普勒血流儀檢測模型大鼠腦血流量的變化，后期的研究應該使用這種更為直觀的方式檢測模型的成功與否。另外，本研究缺乏模型+抗炎藥物組，無法探究神經炎癥在認知障礙中的作用，課題組后續的的研究應該增加這樣一個對照組。綜上所述，本研究表明EE下調VaD大鼠海馬神經炎癥和反應性星形膠質細胞，并促進認知功能的恢復。